Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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säuren und durch SYBR R○ Gold-Färbung nur Nukleinsäuren sichtbar gemacht werden. Mit
Hilfe der entsprechenden Färbemethoden konnten nur von Proteinen verursachte Banden im
SDS-Gel detektiert werden. Eine Nukleinsäurekontamination lag nicht vor.
5.6.2 Überprüfung der Nukleinsäurebindung mittels
Gelverzögerungs-Analysen
Nach erfolgreicher Expression und Reinigung von hTRBP-His sollte überprüft werden, ob
es seine intrinsische Aktivität besitzt, also zur Bindung an doppelsträngige RNA fähig ist.
Zu diesem Zweck wurden Gelverzögerungs-Analysen mit doppel- bzw. einzelsträngiger siRNA
durchgeführt (siehe Abschnitt 4.4.4). Neben der qualitativen Aussage bietet diese Methode den
Vorteil, dass sich eine apparente Dissoziationskonstante (K d, app ) bestimmen lässt. Sie diente
als Richtwert für die spätere Messung des K d mittels Gleichgewichts-Fluoreszenzspektroskopie
(siehe Abschnitt 5.11.1).
Abbildung 5.18 A zeigt die konzentrationsabhängige Bildung verschiedener hTRBP-His/
siRNA-Komplexe in Form von mehreren distinkten Banden sowie ein Fluoreszenzsignal in den
Taschen des Gels. Es wurde bereits durch Gredell et al. gezeigt, dass hTRBP bei der Bindung
des doppelsträngigen RNA-Substrates TAR sowie bei Bindung von siRNA in Gelverzögerungs-
Analysen in verschiedenen oligomeren Zuständen vorliegt (vermutlich als Monomer, Dimer,
Tetramer und in groÿen Komplexen) [237]. Das Fluoreszenzsignal in den Geltaschen deutet
auf die Bildung von Komplexen hin, deren Gröÿe die Porenweite des Gels überschreitet und
sie deshalb nicht quantitativ, sondern nur in Form eines Schmiers knapp unterhalb der Tasche
einlaufen können. In einem alternativen Experiment wurde hTRBP-His vor der Inkubation
mit Nukleinsäure für 1 h bei 20.000 × g oder 150.000 × g und 4 ◦ C zentrifugiert, um aggregiertes
Protein zu sedimentieren. In beiden Fällen wurden die gleichen groÿen Komplexe in den
Geltaschen beobachtet.
Die Bindung doppelsträngiger siRNA durch hTRBP-His ist sättigbar, da das Substrat sich
durch steigende Konzentrationen einer nichtmarkierten, kompetierenden siRNA aus einem
Komplex mit hTRBP-His verdrängen lässt (siehe Abbildung 5.18 B). Einzelsträngige guide
RNA wird durch hTRBP-His mit deutlich geringerer Anität gebunden als doppelsträngige
siRNA. Es kommt nur zur Bildung weniger groÿer Komplexe, die zum Groÿteil nicht in das
Gel einlaufen können (siehe Abbildung 5.18 C).
In allen drei Experimenten fällt die bei zunehmender Proteinkonzentration verstärkt auftretende
Degradation der RNA auf. Sie wird auf die Nukleasekontamination in der hTRBP-
His-Präparation zurückgeführt und lieÿ sich auch durch den Einsatz verschiedener RNase-
Inhibitoren nicht vollständig verhindern. Allerdings lässt die Tatsache, dass einzelsträngige
RNA deutlich stärker abgebaut wird als doppelsträngige, den Schluss zu, dass die Bindung an
hTRBP-His einen schützenden Einuss vor Degradation besitzt.
Nach der Quantizierung des gebundenen RNA-Anteils und der Auftragung gegen die
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