Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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A Anhang Erk extrazellulär regulierte Kinase et al. und an<strong>der</strong>e EtBr Ethidiumbromid FAM 5/6-Carboxyuorescein fmol Femtomol FPLC fast protein liquid chromatography, Hochdurchsatzüssigkeitschromatographie g Erdbeschleunigung (9,81 m/s 2 ) ggf. gegebenenfalls G. intestinalis Giardia intestinalis GST Glutathion-S-Transferase h hour, Stunde H Histidin H 2 O Wasser HA Hämagglutinin hAgo2 humanes Argonaute2 Protein HCl Salzsäure HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure HF high delity, hohe Präzision His Histidin HIV-1 Humanes Immundezienzvirus-1 HPLC high performance liquid chromatography, Hochleistungsüssigkeitschromatographie HRP horseradish peroxidase, Meerrettich-Peroxidase Hsp90 Hitzeschock-Protein 90 ICAM intracellular adhesion molecule, intrazelluläres Adhäsionsmolekül i. d. R. in <strong>der</strong> Regel IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid k Ratenkonstante K 2 HPO 4 Dikaliumhydrogenphosphat k cat Wechselzahl KCH 3 COOH Kaliumacetat KCl Kaliumchlorid K d Gleichgewichts-Dissoziationskonstante kDa Kilodalton K d, app apparente Dissoziationskonstante KH 2 PO 4 Kaliumdihydrogenphosphat Michaelis-Konstante K m 228
A.2 Abkürzungsverzeichnis kV Kilovolt l Liter L-Arg L-Arginin LB Luria Bertani m Meter M Mol pro Liter M -1 s -1 Liter pro Mol und Sekunde m 7 G cap Struktur von reifer mRNA mA Milliampere MAPK mitogen-activated protein kinase, Mitogen-aktivierte Proteinkinase MCS multiple cloning site, multiple Klonierungsstelle mg Milligramm Mg 2+ divalentes Magnesiumion MgCH 3 COOH Magnesiumacetat MgCl 2 Magnesiumchlorid Mid middle min Minuten miRNA microRNA ml Milliliter mm Millimeter mM Millimol pro Liter mmol Millimol mRNA messenger RNA, Boten-RNA ms Millisekunde N 2 Sticksto Na 2 HPO 4 Natriumdihydrogenphosphat Na 3 C 6 H 5 O 7 Natriumcitrat NaCH 3 COOH Natriumacetat NaCl Natriumchlorid NaOH Natriumhydroxid N. crassa Neurospora crassa NF90 Nukleärer Faktor 90 ng Nanogramm (NH 4 ) 2 SO 4 Ammoniumsulfat NI non interfering, nicht interferierend nM Nanomol pro Liter nM -1 Liter pro Nanomol nm Nanometer 229
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Aus dem Institut für Molekulare Me
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Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassun
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4.3.3 Gelelektrophorese zur Analyse
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5.12 Untersuchung des Einusses von
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1 Zusammenfassung Die RNA-Interfere
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Summary RNA interference (RNAi) is
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2 Einleitung 2.1 Über die Bedeutun
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2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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2.3 Die Familie der Argonaute Prote
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2.4 Die strukturellen und molekular
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2.4 Die strukturellen und molekular
Seite 35 und 36:
2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
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2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
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2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
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2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
Seite 43:
2.7 Ziel dieser Arbeit der Freisetz
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3 Material Deutschland), Roche (Bas
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3 Material UV-Quarzküvetten (70 µ
Seite 50 und 51:
3 Material Stains-All Sigma-Aldrich
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3 Material Coomassie-Entfärbelösu
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3 Material Trenngelpuer (4×) 1,5 M
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3 Material pQE-T7-His-hAgo2 Eigensc
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3 Material 3.8.4 Primer Name Ago2 f
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3 Material Anti-Tetra-His (monoklon
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4 Methoden Mini-Präparation (klein
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4 Methoden Acrylamidkonzentration (
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4 Methoden 4.1.6 Restriktionshydrol
Seite 68 und 69:
4 Methoden 4.1.11 Kryokonservierung
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4 Methoden Die in vitro Transkripti
Seite 72 und 73:
4 Methoden 5'-Endmarkierung wurde u
Seite 74 und 75:
4 Methoden schwache Absorption aufw
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4 Methoden Komponente Sammelgel Tre
Seite 78 und 79:
4 Methoden Es wurde für 90 min ein
Seite 80 und 81:
4 Methoden Protein Temperatur der H
Seite 82 und 83:
4 Methoden Die Rückfaltung von hAg
Seite 84 und 85:
4 Methoden Reinigung von hTRBP-His
Seite 86 und 87:
4 Methoden Ansätzen zum Reaktionss
Seite 88 und 89:
4 Methoden Abbildung 4.1: Schematis
Seite 90 und 91:
4 Methoden Xenon‐Lampe Excitation
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4 Methoden gewertet; allerdings die
Seite 94 und 95:
4 Methoden verwendeten Lösungsmitt
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5 Ergebnisse NHA-hAgo2 nur in Anwes
Seite 98 und 99:
5 Ergebnisse NHA hAgo2 A kDa Gesamt
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5 Ergebnisse Konstrukte wurden mit
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5 Ergebnisse hTRBP H A kDa Gesamtze
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5 Ergebnisse NHA hAgo2 A DNaseI & T
Seite 106 und 107:
5 Ergebnisse konnte mit der bisher
Seite 108 und 109:
5 Ergebnisse Präzipitationskontrol
Seite 110 und 111:
5 Ergebnisse Studien zur Optimierun
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5 Ergebnisse zum Anderen den angest
Seite 114 und 115:
5 Ergebnisse 5.4.3 Entwicklung eine
Seite 116 und 117:
5 Ergebnisse die Experimente in ein
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5 Ergebnisse 5.5.3 Einuss der Tempe
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5 Ergebnisse In beiden Experimenten
Seite 122 und 123:
Mass (%) 5 Ergebnisse NHA hAgo2 90
Seite 124 und 125:
5 Ergebnisse NHA hAgo2 A 110 100 B
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5 Ergebnisse säuren und durch SYBR
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5 Ergebnisse Bereich bestimmen [204
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5 Ergebnisse der Gelverzögerungs-A
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5 Ergebnisse Oligomerisierungszusta
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Fluoreszenz cpm 5 Ergebnisse GST hA
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse Bestimmung
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5 Ergebnisse mit unterschiedlichen
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elative Fluoreszenz relative Fluore
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elative Fluoreszenz k 1, obs (s -1
Seite 144 und 145:
5 Ergebnisse Entlassung des guide R
Seite 146 und 147:
5 Ergebnisse A B C FAM FAM P P‐as
Seite 148 und 149:
Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
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5 Ergebnisse guide RNA target RNA k
Seite 152 und 153:
Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
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5 Ergebnisse und ist somit konsiste
Seite 156 und 157:
5 Ergebnisse k = 0,0004 (± 0,00001
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% Umsatz % Umsatz 1/ k k (s -1 ) 5
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% Umsatz 5 Ergebnisse Einsatz der k
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5 Ergebnisse FAM P BHQ 2h 25°C FAM
Seite 164 und 165:
Fluoreszenz 5 Ergebnisse Wie unter
Seite 166 und 167:
Fluoreszenz Fluoreszenz 5 Ergebniss
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elative Fluoreszenz k 1, obs (s -1
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5 Ergebnisse 5.11.3 Zusammenfassung
Seite 172 und 173:
% Umsatz 5 Ergebnisse wird, stehen
Seite 175 und 176:
6 Diskussion Das Protein hAgo2 stel
Seite 177 und 178:
6.1 Untersuchung der siRNA-vermitte
Seite 179 und 180:
6.2 Stabilität von rekombinantem h
Seite 181 und 182:
6.3 Charakterisierung der siRNA-ver
Seite 183 und 184:
Seite 185 und 186:
Seite 187 und 188: 6.3 Charakterisierung der siRNA-ver
Seite 199 und 200: 6.4 Charakterisierung der siRNA-Bin
Seite 201 und 202: 6.4 Charakterisierung der siRNA-Bin
Seite 203 und 204: 6.5 Modell der minimalen rekombinan
Seite 205 und 206: 6.6 Ausblick einer konformationelle
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Seite 209 und 210: 7 Literaturverzeichnis [23] Stefani
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