Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.8 Charakterisierung der target RNA-Bindung durch den binären hAgo2/guide RNA-Komplex
Einblicke in diesen Prozess zu erhalten, wurde in einem ersten experimentellen Ansatz das
uoreszenzbasierte System, das für die Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hAgo2
verwendet wurde (siehe Abschnitt 5.7), um eine Komponente erweitert. Als Modell für eine
target mRNA diente der 21 nt umfassende, mit einem Fluoreszenzlöscher gekoppelte Gegenstrang
zu as2B-FAM, s2B-BHQ (siehe Abbildung 5.31 A). Werden das Fluorophor FAM und
der Löscher BHQ1 in räumliche Nähe zueinander gebracht, wird das von FAM emittierte Licht
mit einer Wellenlänge von 516 nm durch BHQ1 absorbiert. Es kommt zu einer Löschung des
Fluoreszenzsignals, wodurch sich die Bildung eines ternären Komplexes verfolgen lässt. Gleichzeitig
erlaubt das System vor der Bindung der target RNA, die Bildung des binären Komplexes
zu kontrollieren, da auch dieser Schritt zu einer Änderung des Fluoreszenzsignals führt (siehe
Abschnitt 5.7). Diese Kontrolle ist wichtig, da eine Fluoreszenzlöschung auch in Abwesenheit
von hAgo2 auftritt, wenn P-as2B-FAM und s2B-BHQ hybridisieren. Ein weiterer Vorteil bei
der Verwendung eines solchen molecular beacons besteht in einer sehr groÿen Signaländerung,
die zu einem groÿen Signal-zu-Rausch-Verhältnis führt.
Die Position des Fluoreszenzlöschers wurde nach zwei Kriterien gewählt. Zunächst sollten
bei Bindung der target RNA durch den binären Komplex FAM und BHQ1 in möglichst groÿe
räumliche Nähe gebracht werden, um eine gute Signaländerung zu erzielen. Weiterhin sollte
s2B-BHQ nach Möglichkeit ein spaltbares target darstellen. Dafür wurden erneut die Röntgenstrukturdaten
archaebakterieller Argonaute-Proteine herangezogen [119]. Weiterhin lassen
die Studien zur Bildung eines binären Komplexes aus NHA-hAgo2 und guide RNAs mit Fluorophoren
an verschiedenen Positionen (siehe Abschnitt 5.7) die Annahme zu, dass die Position
von BHQ1 am 4. Nukleotid der target RNA nicht zu einer Interferenz mit hAgo2 führt.
Um die Funktionalität von s2B-BHQ zu testen, wurde ein Standard-Spaltungsassay (siehe
Abschnitt 4.4.1) mit GST-hAgo2 und zwei alternativen target RNAs durchgeführt. Statt
des 140 nt umfassenden ICAM-1-IVT kamen dabei s2B und s2B-BHQ zum Einsatz. Allerdings
zeigte sich nach Auftrennung der Spaltungsansätze per Sequenziergel mit anschlieÿender Autoradiographie,
dass die 9 nt langen 5'-Spaltprodukte wegen zu starker RNA-Degradation durch
die Nukleaseverunreinigung der Präparation nicht eindeutig zuzuordnen waren. Deshalb wurde
dem Spaltungsansatz 1 µg/µl tRNA zugesetzt, um die Degradation der target RNAs zu
vermeiden. Es zeigte sich, dass Umsatz von s2B-BHQ durch hAgo2 stattndet (siehe Abbildung
5.42). Die Spaltung ist im Vergleich zu derjenigen von s2B zwar vermindert, doch wird
es durch den Komplex mit vergleichbarer Rate umgesetzt. Folglich handelt es sich dabei um
eine funktionelle target RNA (siehe Abschnitt 5.10).
Zur Bestätigung der mit Hilfe des molecular beacons gewonnenen Daten sowie der weiterführenden
Untersuchung der Bildung ternärer Komplexe wurden zwei zusätzliche experimentelle
Systeme verwendet. Im zweiten Fall wurde der am 5'-Ende phosphorylierte Strang P-s2B als
guide RNA verwendet, wohingegen as2B-FAM als target RNA diente (siehe Abbildung 5.31
B). Beim dritten experimentellen Ansatz wurde der gleiche Strang als guide RNA verwen-
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