Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.4 Techniken zur biochemischen Charakterisierung von rekombinanten Proteinen
dazol (Flussrate 1 ml/min). Es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt, die mittels SDS-PAGE
(siehe Abschnitt 4.3.3) und Coomassie-Färbung (siehe Abschnitt 4.3.4) analysiert wurden. Die
Umpuerung von TRBP-His erfolgte durch Dialyse gegen 2 × 1 l Lagerpuer.
4.3.9 Konzentrierung von Proteinen in Lösung
Vakuum-Dialyse
Bei der Vakuum-Dialyse wurde die zu konzentrierende Proteinlösung in eine Membranhülse
mit adäquater Porengröÿe gefüllt und diese in Kontakt zum gewünschten Puer gebracht. An
das System wurde ein Unterdruck angelegt und dadurch das Lösungsmittel der Proteinlösung
in den Puer gesaugt. Das Volumen der Proteinlösung wurde somit eingeengt und es konnte
bei Bedarf gleichzeitig ein Pueraustausch vorgenommen werden.
Ultraltration
Für diese Konzentrierungsvariante wurden je nach Volumen Amicon Ultra-15 oder Centricon
Ultraltrationseinheiten verwendet. Die Porengröÿe richtete sich dabei nach dem Molekulargewicht
des zu konzentrierenden Proteins. Die Filtration wurde im Zentrifugalfeld mit 5.000 × g
bei 4 ◦ C durchgeführt, bis das gewünschte Retentionsvolumen erreicht war.
Für die gleichzeitige Umpuerung von Proteinlösungen konnte das Retentat mit dem gewünschten
Puer verdünnt, konzentriert und erneut verdünnt werden, bis ein ausreichender
Austausch von Puerkomponenten stattgefunden hatte (Dialtration).
4.3.10 Untersuchung auf RNase-Kontamination
Da die mit RNA durchgeführten Arbeiten Bedingungen erforderten, unter denen möglichst
geringe Degradation stattndet, wurden die einzelnen Proteinpräparationen auf die Aktivität
von RNasen untersucht. Hierzu wurden eine radioaktiv markierte RNA (siehe Abschnitt
4.2.6) mit der jeweiligen Proteinlösung für 1 2 h bei 37 ◦ C inkubiert. Anschlieÿend wurde die
RNA mit Hilfe eines Sequenziergels (siehe Abschnitt 4.1.3) aufgetrennt und über Autoradiographie
(siehe Abschnitt 4.1.4) detektiert. Das Ausmaÿ der Degradation wurde mit Hilfe des
Programms Image Quant 5.2 bestimmt.
4.4 Techniken zur biochemischen Charakterisierung von
rekombinanten Proteinen
Bei den hier genannten Konzentrationen handelt es sich soweit nicht anders vermerkt
um die nalen Konzentrationen der jeweiligen Komponenten. Dies spielt vor allem bei solchen
Reaktionen eine Rolle, bei denen eine Mischung und dadurch eine Verdünnung von zwei
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