Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
A
B
C
FAM
FAM
P
P‐as2B‐FAM
P
P‐s2B
P
P‐as2B‐FAM
+
s2B‐BHQ
FAM
+
as2B‐FAM
+
s2B
BHQ
FAM
FAM
FAM
P
BHQ
P
P
Fluoreszenz
Fluoreszenz
Fluoreszenz
Abbildung 5.31: Schematische Darstellung der Fluoreszenzänderung bei Bildung ternärer Komplexe
unter Verwendung dreier experimenteller Ansätze. Nach Assoziation binärer Komplexe aus GST-hAgo2
(dargestellt durch ein graues Oval) und der jeweiligen guide RNA werden diese mit der jeweiligen
target RNA gemischt. (A) guide RNA: P-as2B-FAM; target RNA: s2B-BHQ. (B) guide RNA: P-s2B;
target RNA: as2B-FAM. (C) guide RNA: P-as2B-FAM; target RNA: s2B. Die Bildung der ternären
Komplexe wurde konzentrationsabhängig (steady state, A) oder zeitaufgelöst (pre-steady state, A C)
durch Fluoreszenzänderung verfolgt. Für Sequenzen siehe Abschnitt 3.8.2.
det, der bereits beim ersten System zum Einsatz gekommen war (P-as2B-FAM). Allerdings
wurde im dritten Fall s2B als target RNA verwendet, ohne dass diese einen Fluoreszenzlöscher
trug (siehe Abbildung 5.31 C). Beim zweiten und dritten Ansatz führte die Assoziation
von binären Komplexen und target RNA nicht zu einer Fluoreszenzlöschung, wie dies bei
Verwendung des molecular beacons beobachtet worden war. Statt dessen führte die veränderte
chemische Umgebung nach Assoziation netto zu einer Fluoreszenzsignalzunahme. Folglich
konnte bei Untersuchung von Dissoziationsprozessen mit den Systemen zwei und drei eine
Netto-Abnahme des Fluoreszenzsignals beobachtet werden.
Zwar sollte es sich bei den drei verwendeten target RNAs (s2B-BHQ, as2B-FAM und s2B)
um funktionelle target RNAs handeln, um die Relevanz des Modellsystems zu gewährleisten.
Allerdings war es für die zunächst geplanten Studien zur Assemblierung des ternären Komplexes
wichtig, dass es nicht zur Spaltung der target RNA kommt, um deren Erkennung und
Bindung durch den binären Komplex isoliert betrachten zu können. Deshalb wurde im Folgenden
die Tatsache verwendet, dass RNAi ein Prozess ist, der von divalenten Metallkationen
abhängt. Durch Entzug von MgCl 2 oder die Komplexierung von Mg 2+ mittels EDTA wird die
target Spaltung inhibiert, kann aber durch Substitution mit Mg 2+ wieder hergestellt werden
[163, 200]. Entsprechende Bedingungen waren für das hier verwendete System mit rekombinantem
GST-hAgo2 bereits getestet worden (siehe Abschnitt 5.5.4). Dabei konnte gezeigt werden,
dass bei der Inkubation eines Standard-Spaltungsassayansatzes in 1 × Ago-Bindungspuer
ohne MgCl 2 keine target RNA-Spaltung erfolgte. Die Assoziation des binären Komplexes
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