Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.3 Expression von rekombinantem hAgo2 und hTRBP
5.3.2 Klonierung von GST-hAgo2 und GST-hAgo2-His
Zur Erhöhung der Löslichkeit wurden zwei weitere hAgo2-Fusionsproteine entworfen, die am
N-Terminus beide mit einer Glutathion-S-Transferase (GST)-Markierung ausgestattet wurden.
Zusätzlich trug ein Konstrukt am C-Terminus eine Poly-His-Markierung.
Als Grundlage für die Klonierungsstrategie diente das Plasmid pET41b(+), welches für
die GST-Sequenz kodiert. Um die Markierungen später vom Protein abspalten zu können,
wurden die Nukleotidsequenzen für eine TEV-Protease- bzw. Thrombin-Schnittstelle in das
Plasmid integriert. Hierfür wurde pET41b(+) mit den Restriktionsenzymen SpeI und BlpI
linearisiert, mittels Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und mit einem zuvor hybridisierten
DNA-Oligonukleotid ligiert, welches zu den generierten Enden des Plasmids kompatibel war.
Zwischen den Sequenzen für die Protease-Schnittstellen wurde auf diesem Weg eine neue
multiple cloning site sowie direkt hinter der Sequenz für die Thrombin-Schnittstelle eine Poly-
His-Sequenz, gefolgt von einem Stopp-Codon, eingeführt (siehe Abbildung 5.3 A).
Das derart modizierte Plasmid pET41b(+)_modiziert wurde durch Elektroporation in
den E. coli Stamm DH5α eingebracht, die Bakterienzellen kultiviert und das vervielfältigte
Plasmid pET41b(+)_modiziert isoliert. Es folgte eine weitere Linearisierung durch die
Restriktionsenzyme AII und AgeI sowie die Reinigung mittels Agarose-Gelelektrophorese.
Mit dem Plasmid pET41b(+)-hAgo2-His als Vorlage wurde die kodierende Sequenz für
hAgo2 mit Hilfe von PCR ampliziert sowie kompatible Enden generiert. In einem Fall wurde
nach der kodierenden Sequenz ein Stopp-Codon eingeführt, um die Transkription der
sich anschlieÿenden Thrombin-Schnittstelle und Poly-His-Markierung zu verhindern. Beide
A
B
AgeI BlpI T7
Transkriptionsstart
Thrombin
Kanamycin
C
BlpI T7
AgeI Transkriptionsstart
*
Thrombin
Kanamycin
hAgo2
hAgo2
TEV
Thrombin
multiple cloning site H
SpeI AflII AgeI * BlpI
pET41b(+)-GST-hAgo2-His
8244 bp
pET41b(+)-GST-hAgo2
8247 bp
AflII
SpeI
TEV
AflII
SpeI
TEV
Abbildung 5.3: Vektorkarten der GST-hAgo2-Fusionskonstrukte. (A) Schematische Darstellung
des DNA-Oligonukleotides zur Modikation von pET41b(+). (B, C) Vektorkarten der Konstrukte
für die Expression von GST-hAgo2-His und GST-hAgo2. Beide Plasmide beinhalten einen T7-
Promotor, ein Kanamycinresistenzgen sowie die Sequenzen für die GST- und Poly-His-Markierungen
und Protease-Schnittstellen. Ein zusätzlich eingeführtes Stopp-Codon (*) verhindert die Transkription
von Thrombin-Schnittstelle und Poly-His-Markierung bei pET41b(+)-GST-hAgo2. H, dunkelbraun:
Poly-His-Markierung. Dunkelblau: GST-Markierung.
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