Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.4 Präparation von rekombinantem hAgo2 und hTRBP
Reinigung mittels Anitätschromatographie unter nicht-denaturierenden
Bedingungen
Für die beiden Konstrukte His-hAgo2 und hAgo2-His ergab sich die Möglichkeit einer anitätschromatographischen
Reinigung. Zwar lag nur ein geringer Proteinanteil von ca. 10 % in
gelöster Form vor (siehe Abbildung 5.2), jedoch wurde aus den bereits genannten Gründen für
eine Reinigung unter nicht-denaturierenden Bedingungen zunächst diese Strategie verfolgt.
Die Untersuchungen wurden mit hAgo2-His durchgeführt und sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst.
Die Integrität der Ni 2+ -NTA-Säulenmatrix wurde getestet, indem ein GST-His-
Fusionsprotein nach Herstellerangaben erfolgreich gereinigt wurde.
Zellaufschluss Elution Säulenmaterial Maÿstab
50 mM Tris pH 7,4 linear 5 500 mM Imidazol 1,5 ml Ni 2+ -NTA präparativ
0,5 mM DTT in 100 min
1 mM PMSF
40 ml pro 14 g Zellen
50 mM Tris pH 7,4 linear 0 500 mM Imidazol 1,5 ml Ni 2+ -NTA präparativ
40 ml pro 14 g Zellen in 100 min
50 mM Tris pH 7,4 150 mM Imidazol 150 µl TALON analytisch
0,5 mM DTT
1 mM PMSF
151 µl pro 50 mg Zellen
50 mM Tris pH 7,4 pH 4,4 150 µl TALON analytisch
0,5 mM DTT
1 mM PMSF
151 µl pro 50 mg Zellen
Tabelle 5.1: Getestete Bedingungen für die nicht-denaturierende Reinigung von hAgo2-His.
Bei den untersuchten experimentellen Bedingungen zeigte sich, dass sowohl die Bindung von
hAgo2-His an das Säulenmaterial als auch die Elution des Proteins problematisch waren, was
zu sehr geringen Ausbeuten führte. Deshalb wurde die Reinigungsstrategie geändert, um den
wesentlich gröÿeren unlöslichen Proteinanteil unter denaturierenden Bedingungen zu isolieren.
Reinigung mittels Anitätschromatographie unter denaturierenden
Bedingungen
Für die systematische Entwicklung eines Protokolls wurde zunächst die Bindung von hAgo2-
His an die Säulenmatrix und im Anschluss die Elution des Zielproteins untersucht. Dabei
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