Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
die Experimente in einem Zeitfenster durchgeführt, in dem die Nuklease-Kontamination nicht
zum Tragen kam.
5.5.2 Überprüfung der sequenzspezischen Spaltungsaktivität
Nach der erfolgreichen Präparation der hAgo2-Konstrukte sollten die Proteine hinsichtlich
ihrer enzymatischen Aktivität getestet werden. Da hAgo2 eine intrinsische Nukleasefunktion
besitzt und charakteristische Spaltprodukte generiert, die in Abhängigkeit des guide Stranges
eine denierte Länge aufweisen, wurde die Spaltungsaktivität als Maÿ der enzymatischen
Aktivität herangezogen.
Die einzelnen Proteinpräparationen wurden mit der guide RNA as2B und der komplementären
target RNA ICAM-1-IVT unter Standard-Bedingungen inkubiert und der Umsatz bestimmt
(siehe Abschnitt 4.4.1). In Abbildung 5.12 ist die Spaltungsaktivität von NHA-hAgo2,
hAgo2-His und GST-hAgo2 gezeigt.
Alle Konstrukte zeigen eine zeitabhängige, sequenzspezische Spaltung der komplementären
target RNA, nicht jedoch in Abwesenheit einer guide RNA oder in Anwesenheit einer nichtkomplementären
guide RNA. Die Spaltprodukte weisen eine Länge von 87 nt auf, was einer
Spaltung an der kanonischen Stelle, also gegenüber des Phosphatrückgrates zwischen dem 10.
und 11. Nukleotid des guide Stranges von seinem 5'-Ende aus, entspricht.
Beim Vergleich des maximalen Umsatzes der drei Konstrukte fällt auf, dass hAgo2-His
nur 13 14 % des maximalen Umsatzes von NHA-hAgo2 bzw. GST-hAgo2 erreicht. Die Rate
der Spaltungsreaktion ist bei allen Konstrukten vergleichbar und für ein Enzym unerwartet
langsam: hRNase H1 besitzt einen putativ ähnlichen RNA-Spaltungsmechanisums [26] und ist
mit einer Geschwindigkeit von 0,05 s -1 ca. 100-fach schneller [203]. Da die Konstrukte sich in
erster Linie durch die Position ihrer jeweiligen Markierungen unterscheiden, ist zu vermuten,
dass diese Einuss auf die enzymatische Aktivität besitzt. Dabei scheint der Carboxy-Terminus
von hAgo2 für die Anfügung zusätzlicher raumfordernder Strukturen ungeeignet zu sein. Da die
Ratenkonstanten der Spaltungsreaktion aller drei Konstrukte jedoch vergleichbar sind, scheint
die Beeinträchtigung bei hAgo2-His bei einem der eigentlichen Spaltung vorgelagerten Prozess
aufzutreten. Hierbei könnte es sich um die Bindung des guide Stranges und die Ausbildung
eines stabilen binären Komplexes handeln.
Bei wiederholt durchgeführten Spaltungsassays wurde beobachtet, dass der maximale Umsatz
von hAgo2 mit einer Lagerungszeit über mehrere Monate kontinuierlich abnimmt. Auf
die Ratenkonstanten hat die Lagerung keinen Einuss. Die in Abbildung 5.12 gezeigten Experimente
wurden jeweils zeitnah nach der Präparation der Proteine durchgeführt und lassen
deshalb vergleichende Schlüsse zu.
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