Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.4 Techniken zur biochemischen Charakterisierung von rekombinanten Proteinen
Abbildung 4.3: Schematischer Aufbau einer DLS-Apparatur. Der Laser strahlt Licht der Wellenlänge
830 nm aus, welches polarisiert wird und auf die temperierte Proteinlösung trit. Die Photonen werden
an den zahlreichen Streuzentren um den Winkel θ abgelenkt, passieren eine Blende und eine Linse,
bevor sie über Glasfaserkabel vom Photomultiplier detektiert werden. Dieser zeichnet die zeitabhängigen
Fluktuationen des Streulichtes auf. Der Korrelator berechnet die Autokorrelationsfunktion, auf
deren Grundlage die Parameter der Proteinlösung bestimmt werden.
und somit eine elektromagnetische Welle erzeugt wird, die die Frequenz des abgelenkten Photons
verändert.
Wenn eine Proteinlösung mit monochromatischem Licht bestrahlt wird, wird es an vielen
Streuzentren gleichzeitig abgelenkt (Rayleigh-Streuung). Auf Grund der Brown' schen Molekularbewegung
diundieren die Proteine und es kommt zu einer Frequenzverschiebung (Doppler-
Eekt), die bei langsamen Molekülen geringe, bei schnellen Molekülen starke Fluktuationen
bewirken. Dieses Phänomen wird als Dynamische oder Quasielastische Lichtstreuung bezeichnet.
Die Messung dieser Fluktuationen in Abhängigkeit der Zeit gibt Aufschluss über die
Geschwindigkeit der sich bewegenden Proteine und dadurch über den Diusionskoezienten.
Hieraus lassen sich bei bekannter Viskosität des Lösungsmittels der hydrodynamische Radius
und somit das Molekulargewicht eines Partikels berechnen (siehe Anhang A.1.3). Auÿerdem
lässt sich eine Aussage über die Polydispersität einer Proteinlösung machen. Die Probe gilt
für weniger als 20 % relative Standardabweichung als monodispers, von 20 30 % spricht man
von mittlerer Dispersität und bei über 30 % von polydispers.
Die Dynamische Lichtstreuung wurde verwendet, um Oligomerisierungszustände von Proteinen
zu untersuchen und Komplexe mit Nukleinsäuren zu charakterisieren. Es wurde das Gerät
DynaPro MS/X verwendet (siehe Abbildung 4.3). Die Datenaufzeichnung und -auswertung erfolgte
mit dem Programm DynaPro Dynamics 6.7.3.
Die Messungen erfolgten, soweit nicht anders angegeben, in einer 12 µl Quarz-Küvette bei
einer Temperatur von 25 ◦ C in 20 s-Intervallen mit jeweils 15 Messungen. Die Viskosität des
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