Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
schwindigkeitsratenkonstante der Hydrolyse mit einhergehender verlässlicher mechanistischer
Interpretation sind demnach weiterführende Experimente nötig.
6.3.4 Die Freisetzung der Spaltprodukte limitiert die Geschwindigkeit der
Reaktion bei multiplem Umsatz
Abschlieÿend wurde die Freisetzung der Spaltprodukte aus dem ternären Komplex isoliert von
anderen Schritten der Reaktion betrachtet. Sowohl der zelluläre RISC als auch rekombinantes
hAgo2 sind zum multiplen Umsatz fähig [6163]. Daher muss für die Regeneration des target
RNA-bindenden binären Komplexes nach der Phosphodiesterhydrolyse die Freisetzung der
Spaltprodukte erfolgen. Dieser Prozess gilt als geschwindigkeitsbestimmend. In D. melanogaster
Embryolysat kann die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion durch Zusatz von ATP zu
einem in vitro Spaltungsansatz um das 4-fache gesteigert werden [63], während dies bei Verwendung
von rekombinantem GST-hAgo2 statt einem Zelllysat nicht der Fall ist [62]. Es muss
also im zellulären RISC eine Komponente geben, die ATP-abhängig die Spaltproduktfreisetzung
beschleunigt, und diese ist nicht identisch mit hAgo2. Die in dieser Arbeit beobachtete
geschwindigkeitsbestimmende Rate beträgt 0,0004 s -1 . Bei einer Vervierfachung (0,0016 s -1 )
liegt die Geschwindigkeit im Bereich der nächst langsameren Geschwindigkeitsratenkonstante,
die der Assemblierung katalytisch kompetenter ternärer Komplexe unter Freisetzung des
3'-Endes des guide Stranges entspricht (siehe Abschnitt 5.8.3).
Es gelang die Bestimmung der Ratenkonstante für die Dissoziation von Spaltprodukten aus
dem ternären Komplex. Jedoch muss davon ausgegangen werden, dass parallel die Dissoziation
ungespaltener target RNA beobachtet wurde, da sowohl ternäre Komplexe mit gebundenen
Spaltprodukten als auch solche mit gebundener, ungespaltener target RNA gleichzeitig während
der Messung vorlagen. Die Daten deuten darauf hin, dass beide Prozesse mit der gleichen
Geschwindigkeit ablaufen, da die Dissoziationsreaktion einen einphasigen Verlauf zeigte (siehe
Abschnitt 5.10.2). Die ermittelte Ratenkonstante entspricht mit 0,0003 s -1 fast exakt derjenigen
der Gesamtreaktion (k gesamt = 0,0004 s -1 ). Damit kann die Annahme bestätigt werden,
dass es sich bei der Freisetzung der Spaltprodukte nach erfolgter Phosphodiesterhydrolyse
um den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Gesamtreaktion handelt. Auÿerdem ist die
Ratenkonstante der Produktfreisetzung identisch mit der dritten Dissoziationsratenkonstante
bei dem Zerfall ternärer Komplexe. Dies stellt einen weiteren Hinweis dafür dar, dass die
Freisetzung von gespaltener und ungespaltener target RNA aus dem ternären Komplex nach
dem gleichen Mechanismus ablaufen.
Zuletzt wurde eine mögliche Dissoziation ternärer Komplexe durch Temperaturerhöhung
untersucht. Es kam nicht zu einem Zerfall in einem Bereich von 25 60 ◦ C, was die mittels Dynamischer
Lichtstreuung gewonnenen Daten bestätigte (siehe Abschnitt 5.5.5). Daraus lässt
sich schlieÿen, dass GST-hAgo2 einen stabilisierenden Einuss auf die hybridisierten Nukleinsäuren
besitzt. Zusammen mit der sehr langsamen Dissoziationsratenkonstante von ternären
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