Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

% Umsatz
5.12 Untersuchung des Einusses von hTRBP auf die siRNA-vermittelte targetRNA-Spaltung
A
+ + + +
- - - -
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
GST
+ +
+ +
+ +
- -
+ +
- -
+ +
- -
hAgo2
GST-hAgo2
hTRBP-His
target RNA
siRNA
t (min)
21 nt
s2B
B
60
50
40
mit TRBP
ohne TRBP
30
20
11nt
7nt
10
5’-
Spaltprodukt(e)
0
0 2000 4000 6000 8000
Zeit (s)
Abbildung 5.48: Einuss von hTRBP-His auf die Spaltungsaktivität von GST-hAgo2 nach seiner
Programmierung mit doppelsträngiger siRNA (siehe Abschnitt 4.4.1). (A) Modizierter Spaltungsassay
mit 3,7 µM GST-hAgo2, 100 nM P-si2B und 2,5 nM s2B. In einem Ansatz erfolgte die Präinkubation
von siRNA und 3,7 µM hTRBP-His für 8 min bei 25 ◦ C, bevor target RNA und GST-hAgo2 zugegeben
wurden. Der andere Ansatz wurde in Abwesenheit von hTRBP-His präinkubiert. Es folgten eine Auftrennung
durch denaturierende PAGE und Detektion mittels Autoradiographie. Als Kontrolle wurde
target RNA mit GST-hAgo2 und hTRBP-His gleichzeitig oder nur mit GST-hAgo2 ohne siRNA inkubiert.
(B) Die ermittelten Umsätze wurden gegen die Zeit aufgetragen und die korrespondierenden Raten
(k -hTRBP-His = 0,0002 (± 0,00006) s -1 bzw. k +hTRBP-His = 0,0012 (± 0,00006) s -1 ) und die maximalen
Umsätze (max. Umsatz -hTRBP-His = 25,6 (± 0,04) % bzw. max. Umsatz +hTRBP-His = 41,2 (± 0,32) %)
durch Anpassung der experimentellen Daten an eine einfach exponentielle Gleichung ermittelt. T1:
durch T1-Verdauung hergestellter Gröÿenmarker. t: Zeit.
Banden höherer elektrophoretischer Mobilität. Dies muss auf die Anwesenheit von hTRBP-
His zurückzuführen sein. Die Proteinpräparation enthält eine Nuklease-Verunreinigung, wie
ein Kontrollansatz zeigt. Dadurch kann es zu einer Verkürzung der siRNA vor der Ladung
auf hAgo2 gekommen sein, wodurch sich die Spaltstelle innerhalb der Sequenz verschiebt.
Da auch die target RNA während der Inkubationszeit teilweise hAgo2-unabhängig degradiert
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