Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.3 Methoden im Umgang mit Proteinen
Präparation von NHA-hAgo2, hAgo2-His und His-hAgo2 aus inclusion bodies
Puer
Komponente
Lysispuer (1 ×) 50 mM Tris (pH 7,5)
1 mM EDTA
1 mM PMSF
0,5 mM DTT
Detergenzpuer (3 ×) 6 % (v/v) Triton-X-100
1,5 M NaCl
60 mM EDTA
Waschpuer (1 ×) 50 mM Tris (pH 7,5)
1 mM EDTA
1 mM PMSF
Solubilisierungspuer (1 ×) 100 mM CAPS (pH 12,0)
2 M Harnsto
500 mM L-Arg
Rückfaltungspuer (1 ×) 100 mM Tris (pH 7,5)
500 mM L-Arg
Tabelle 4.11: Puerzusammensetzung für die Präparation von hAgo2 aus inclusion bodies.
Für die Zelllyse wurden E. coli Zellen, in denen zuvor die Expression des jeweiligen rekombinanten
Proteins induziert worden war (siehe Abschnitt 4.3.6), in 100 ml kaltem Lysispuer
pro Ernte aus 2 l Kulturvolumen durch Rühren bei 4 ◦ C resuspendiert. Der Suspension wurde
100 µg/ml Lysozym zugesetzt und für 15 min rührend bei 4 ◦ C inkubiert. Anschlieÿend wurde
die Suspension 15 × 20 s mit Ultraschall bei 70 % Power und 100 % Cycle behandelt, gefolgt
von 20 s Inkubation auf Eis.
Zum Abbau von DNA wurde die Suspension auf 3 mM MgCl 2 eingestellt, mit 10 µg/ml
DNaseI versetzt und für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Zellwandbestandteile wurden
durch Zugabe eines halben Volumens Detergenzpuer und Inkubation für 30 min bei 4 ◦ C
solubilisiert.
Die folgende Zentrifugation für 30 min bei 4 ◦ C und 18.000 × g trennte die unlöslichen Einschlusskörperchen
und verbliebenen Zelltrümmer von löslichen Komponenten. Das Sediment
wurde 2 × mit 100 ml und 1 × mit 30 ml Waschpuer gewaschen und anschlieÿend die in
den Einschlusskörperchen enthaltenen Proteine durch Resuspension in 20 ml semidenaturierendem
Solubilisierungspuer in Lösung gebracht. Die unlöslichen Bestandteile wurden für
20 min bei 4 ◦ C und 20.000 × g abzentrifugiert.
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