Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2 Einleitung
A
B
578 859
807
669 700 856‐
597 859
D D P H MYFA
PIWI
slicing
hydrophobe
Region
D546
D478
D660
U11'
C10'
Lokalisation
Abbildung 2.6: Die PIWI Domäne. (A) Röntgenkristallstruktur der isolierten PIWI Domäne aus
einem ternären Komplex von T. thermophilus Argonaute, einer 21 nt langen guide DNA sowie einer
20 nt langen target RNA (PDB 3F73). Die hervorgehobenen Aminosäuren D597, D669 und H807
bilden die Katalytische Triade von hAgo2 [62]. P700 ist an der zellulären Lokalisation von hAgo2
beteiligt [135]. Der hydrophobe C-Terminus bildet einen Teil der Kontaktäche zur Mid Domäne und
ist vermutlich an der Bindung des guide RNA-5'-Endes beteiligt [130]. (B) Vergröÿerungsausschnitt
des aktiven Zentrums innerhalb der PIWI Domäne aus (A). Die target RNA (blau) wird zwischen C10'
und U11' in räumliche Nähe zur Katalytischen Triade gebracht, die im T. thermophilus Ago aus D478,
D546 und D660 besteht. Das Mg 2+ -Ion (cyanfarben) ist essentiell für die endonukleolytische Spaltung
[163].
den funktionellen Status von Ago dienen kann [130]. Weiterhin enthält die PIWI Domäne die
Aminosäure P700, die eine Rolle bei der Lokalisation von hAgo2 in PB spielt (siehe Abschnitt
2.3.1).
Neben der katalytischen Aktivität könnte die PIWI Domäne auch eine Rolle bei der target
Erkennung spielen. Experimentelle Daten weisen darauf hin, dass es in C. elegans nach der
Bindung der guide RNA durch ein Ago Protein zum Arrangement des seed Bereiches kommt,
so dass die Basen gut zugänglich werden für eine Interaktion mit der target RNA [169]. Für T.
thermophilus Ago im Komplex mit einer 21 nt langen guide DNA und einer 20 nt langen target
RNA konnten Wang et al. zeigen, dass die Aminosäuren R580, T613, R615, R651, H657, R661
und V685 innerhalb der PIWI Domäne an der Koordination des Phosphatrückgrates der guide
DNA beteiligt sind [119].
2.4 Die strukturellen und molekularen Grundlagen der
siRNA-vermittelten RNAi
2.4.1 Anforderungen an kleine regulatorische RNAs und target RNAs
Neben dem Ago Protein spielt die kleine regulatorische RNA, mit der das Eektorenzym
programmiert wird, innerhalb des RISC eine entscheidende Rolle. Dabei müssen siRNAs und
miRNAs eine Reihe von Kriterien erfüllen.
Zunächst ist es im zellulären Kontext unabdingbar, dass regulatorische RNAs vor al-
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