Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...
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5.7 <strong>Charakterisierung</strong> <strong>der</strong> <strong>siRNA</strong>-Bindung durch hAgo2<br />
A<br />
B<br />
C<br />
Abbildung 5.22: Übersicht über die verwendeten <strong>siRNA</strong>-Substrate. (A) Schematische Darstellung<br />
des am 5'-Ende phosphorylierten guide Stranges P-as2B-FAM. (B) Schematische Darstellung des unphosphorylierten<br />
guide Stranges OH-as2B-FAM. (C) Schematische Darstellung des Hybrides aus P-<br />
as2B-FAM und dem komplementären unphosphorylierten passenger Strang s2B. Für Sequenzen siehe<br />
Abschnitt 3.8.2.<br />
5.7.2 Anität von hAgo2 zu verschiedenen <strong>siRNA</strong>-Substraten<br />
Für die Untersuchung <strong>der</strong> Substratanität von hAgo2 wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen<br />
(steady state) Dissoziationskonstanten bestimmt. Dazu wurde im Wesentlichen<br />
Gleichgewichts-Fluoreszenzspektroskopie angewendet (siehe Abschnitt 4.4.2). Um die gewonnenen<br />
Daten durch eine unabhängige Methode zu bestätigen, wurden zusätzlich Filterbindungsexperimente<br />
(siehe Abschnitt 4.4.2) sowie Gelverzögerungs-Analysen (siehe Abschnitt<br />
4.4.4) durchgeführt.<br />
Bestimmung <strong>der</strong> Anität zu ssRNA<br />
Eine Gleichgewichts-Fluoreszenztitration mit NHA-hAgo2 erwies sich als schwierig, da die<br />
Verdünnung des Proteins im Messpuer durch die Titrationsschritte gleichzeitig die Verdünnung<br />
von L-Arg bedeutet. Die plötzliche Konzentrationsabnahme dieser das Protein stabilisierenden<br />
Substanz führte zur Aggregation. Neben <strong>der</strong> potentiellen Inaktivierung und damit<br />
Verfälschung <strong>der</strong> Daten hatte die Bildung groÿer Aggregate zusätzlich zur Folge, dass die<br />
Fluoreszenz ab einer bestimmten NHA-hAgo2-Menge in atypischer Weise zunahm. Vermutlich<br />
wurde dies dadurch verursacht, dass durch FAM emittiertes Licht an Partikeln gestreut wurde<br />
und deshalb die Messung verfälschte. Deshalb wurden Gleichgewichts-Fluoreszenztitrationen<br />
zur Ermittlung von K d s mit GST-hAgo2 durchgeführt.<br />
Bei <strong>der</strong> Gleichgewichts-Fluoreszenztitration von GST-hAgo2 mit P-as2B-FAM (siehe Abbildung<br />
5.22 A) konnte eine Gesamtuoreszenzän<strong>der</strong>ung von ca. 26 % erreicht werden. Die<br />
mathematische Auswertung <strong>der</strong> Titrationskurve mit Hilfe einer quadratischen Bindungsgleichung<br />
ergab eine Gleichgewichts-Dissoziationskonstante von 7,1 (± 2,1) nM (siehe Abbildung<br />
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