Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
phosphorylierter guide RNA als vermindert beschrieben wurde [35, 199]. Weiterhin ist dieses
Ergebnis konsistent mit strukturellen Daten prokaryonter Ago Proteine im Komplex mit einer
an ihrem 5'-Terminus phosphorylierten guide DNA [119]. Diese Daten implizieren, dass
die Phosphatgruppe durch ein Mg 2+ -Ion sowie einige konservierte Aminosäuren koordiniert
wird und dadurch für die korrekte Positionierung des guide Stranges verantwortlich ist (siehe
Abbildung 2.5 B). Tabelle 6.2 zeigt einen Vergleich des in dieser Arbeit ermittelten K d s mit
einer vergleichbaren Konstante aus der Literatur. Wie bereits oben diskutiert, lässt sich die
Abweichung beider Werte durch Unterschiede im experimentellen System erklären. In beiden
Fällen ist der K d jedoch höher als bei einem Komplex, der aus hAgo2 und einer am 5'-Ende
phosphorylierten guide RNA besteht. Im hier untersuchten Fall unterscheiden sich beide um
den Faktor 15. Im Fall von Lima et al. ist die Abweichung mit einem Faktor 5 geringer ausgeprägt.
In beiden Fällen wird jedoch die wichtige Rolle der kritischen Phosphatgruppe bei der
Verankerung des guide RNA-5'-Endes deutlich.
K d (nM)
Protein
experimentelles System
Substrat
Referenz
106 bakteriell exprimiertes OH-as2B-FAM (21 nt) Abschnitt 5.7.2
rekombinantes GST-hAgo2
395 in Sf9-Zellen exprimiertes 19-as (19 nt) [199]
rekombinantes GST-hAgo2
Tabelle 6.2: Vergleich verschiedener Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für Komplexe aus humanem
(h) Ago2 und am 5'-Ende nicht-phosphorylierter einzelsträngiger guide RNA.
Im zellulären Kontext tragen miRNAs und siRNAs auf Grund ihrer Biogenese durch Dicer
eine 5'-Phosphatgruppe [3133]. Es ist nicht bekannt, ob endogen siRNA- oder miRNA-
Substrate existieren, die dieses Charakteristikum nicht aufweisen. Falls dies der Fall sein sollte,
wäre eine gezielte Dephosphorylierung als regulatorischer Prozess vorstellbar, um ungewünschte
siRNAs oder miRNAs in geringerem Maÿ in den RISC einzubauen. Jedoch sind diese Annahmen
spekulativ.
Bislang galt die Programmierung von rekombinantem hAgo2 mit einer doppelsträngigen
siRNA als unmöglich. Der Umsatz von target RNA fand im Gegensatz zur Beladung mit einem
einzelsträngigen guide Strang bei den Arbeitsgruppen um Liu und Lima nicht statt [35,
199]. Auÿerdem gelang nicht eine UV-induzierte Vernetzung von hAgo2 mit einer doppelsträngigen
siRNA, wohingegen dies für eine einzelsträngige guide RNA gezeigt werden konnte [200].
Bei den Studien zur Substratanität zeigte GST-hAgo2 eine unerwartet hohe Anität zur
doppelsträngigen P-si2B (K d = 47,9 nM). Damit ist die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante
für einen Komplex aus GST-hAgo2 und die doppelsträngige P-si2B-FAM nur etwa 7-fach
gröÿer als diejenige für den die einzelsträngige P-as2B-FAM enthaltenden Komplex. Sie ist
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