Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Mass (%)
5 Ergebnisse
NHA
hAgo2
90
80
1
70
60
50
40
30
20
10
2
3
0
0,1 1 10 100 1000
Rh (nm)
Population
R h
(nm)
Pd
(%)
MW-R
(kDa)
Mass
(%)
1 7,6 0,0 391 79,4
2 24,7 11,7 6099 19,8
3 89,5 15,2 124022 0,8
Abbildung 5.15: Regularisierungs-Histogramm der Dynamischen Lichtstreuung durch 24,1 µM NHAhAgo2
in Rückfaltungspuer (siehe Abschnitt 4.4.5). Die Messung wurde bei 25 ◦ C durchgeführt. Die
unterschiedliche Breite der Balken im Histogramm erklärt sich durch die logarithmische Abszissenachse.
Mass: Massenanteil. R h : hydrodynamischer Radius. Pd: Polydispersität. MW-R: auf Grundlage
von R h berechnetes Molekulargewicht.
schen Radius kleiner als 1 nm konnte durch eine Kontrollmessung mit Puer als von einem
Lösungsmittelbestandteil verursacht identiziert werden. Alle Signale auÿerhalb des Messbereiches
wurden als Artefakte gewertet.
Für die Separation der beobachteten Spezies wurde eine fraktionierte Zentrifugation für
10 min bei 4 ◦ C und 3.000 20.000 × g durchgeführt und die gewonnenen Überstände analysiert.
Es zeigte sich bei allen Ansätzen ein ähnliches Bild, weshalb die Zentrifugation bei
150.000 × g für 1 h wiederholt wurde, um Bestandteile, die gröÿer als 50 nm sind, zu sedimentieren.
Der Überstand wurde abgenommen und das Sediment im gleichen Volumen Rückfaltungspuer
vorsichtig resuspendiert, um die Zusammensetzung der Populationen nicht zu
verändern. Aggregate konnten erfolgreich abgetrennt und Population 1 isoliert werden (siehe
Abbildung 5.16). Die Bestimmung der Proteinkonzentration in beiden Fraktionen mittels NI
Assay zeigte, dass durch die Zentrifugation etwa 20 % der Gesamtproteinmenge sedimentiert
wurde. Dies entspricht dem Massenanteil von Populationen 2 und 3 (siehe Abbildung 5.15).
Das im Überstand enthaltene NHA-hAgo2 wurde einem Standard-Spaltungsassay unterzogen
und zeigte die kanonische sequenzspezische Spaltungsaktivität (siehe Abbildung 5.13). Somit
konnte gezeigt werden, dass es sich bei Population 1 um diejenige Fraktion handelt, die
enzymatisch aktives hAgo2 enthält.
Population 1 war über mehrere Wochen bei 4 ◦ C lagerfähig, ohne dass es zur Bildung weiterer
Populationen in der Lösung kam. Auch eine Inkubation bei Raumtemperatur über mehrere
Stunden führte nicht zur Aggregatbildung, im Gegensatz zur Inkubation auf Eis. Für einen
Zeitraum von 15 min blieb der Massenanteil von Population 1 konstant. Nach einer Stunde
allerdings nahm der entsprechende Anteil um 15 % ab.
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