Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.3 Methoden im Umgang mit Proteinen
Nachweis von His
1 h 16 h, 4 ◦ C 2 × 10 min 1 h 4 × 10 min
Blockpuer III α-Penta/Tetra/ TBS-T α-Maus-HRP TBS-T
( ∗ ) RGS-His 1 × 10 min 1:1000 in Block-
1:5000 in Block- TBS puer IV
puer III
Nachweis von GST
30 min 1 h 5 × 5 min
Blockpuer I α-GST-HRP TBS-T
1:200 in Blockpuer
I
Nachweis von HA
1 h 16 h, 4 ◦ C 4 × 5 min
RotiBlock α-HA-HRP TBS-T
1:7500 in RotiBlock 1 × 5 min
TBS
( ∗ ) Vor der Blockierung wurde die Membran 2 × 10 min mit TBS und nach der
Blockierung 2 × 10 min mit TBS-T sowie 1 × 10 min mit TBS gewaschen.
Tabelle 4.9: Versuchsbedingungen für die Immundetektion verschiedener Epitope.
4.3.6 Expression von rekombinanten Proteinen in E. coli Bakterien
Für die Expression rekombinanter Proteine wurden E. coli Kulturen als Schüttelkultur bis 2 l
oder in einem Fermenter mit 10 l Volumen verwendet. Für das Animpfen der jeweiligen Hauptkultur
wurde eine adäquate Bakterienkolonie von einer Agarplatte mit Selektionsantibiotikum
zunächst in eine Vorkultur überführt. Diese wurde bei 37 ◦ C und 200 rpm für mindestens 16 h
inkubiert. Für das Animpfen sehr groÿer Volumina wurde ggf. das Volumen der Vorkultur
nach 8 h Inkubation expandiert. In der Hauptkultur wurde die Vorkultur dermaÿen verdünnt,
dass sich eine OD 600 von 0,1 0,2 einstellte. Die Bakterien wurden bei 17 37 ◦ C und 200 rpm
inkubiert, bei der Fermentation wurde der Kultur zusätzlich Luft zugeführt und extensive
Schaumbildung durch Zugabe von AntiFoam verhindert. Beim Erreichen einer OD 600 von
0,8 1,0 wurde die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Die Induktionsdauer
wurde in Abhängigkeit des Proteins gewählt. Die Zellernte erfolgte bei 4 ◦ C und
5.000 20.000 × g für 5 45 min. Sofern die Zellen nicht sofort verwendet wurden, wurden sie
bei 20 ◦ C bzw. 80 ◦ C gelagert. Tabelle 4.10 gibt einen Überblick über die Expressionsbedingungen
der einzelnen Proteine.
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