Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.4 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hTRBP
6.4.2 Die Bindung von siRNA durch hTRBP beruht auf einer schnellen
konformationellen Umlagerung
Bislang sind nach eigenem Kenntnisstand keine transientenkinetischen Studien der siRNA-
Bindung durch hTRBP veröentlicht. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten presteady
state Analysen zeigen einen zweiphasigen Verlauf der Bindungsreaktion (siehe Abschnitt
5.11.2). Da die Geschwindigkeit der ersten Phase abhängig von der hTRBP-His-
Konzentration ist, repräsentiert sie vermutlich die diusionskontrollierte Bildung initialer
Kollisionskomplexe. Obwohl hTRBP-His mit 40,4 kDa ein deutlich kleineres Protein darstellt
als GST-hAgo2 mit 124,3 kDa, sind die entsprechenden Assoziationsratenkonstanten ähnlich
(k 1, GST-hAgo2/siRNA = 1,2 × 10 8 M -1 s -1 bzw. k 1, hTRBP-His/siRNA = 1,9 × 10 8 M -1 s -1 ). Dies könnte
darauf hinweisen, dass hTRBP-His nicht in monomerer Form in Lösung vorliegt und ist
konsistent mit den Erkenntnissen zur Bildung von Oligomeren (siehe Abschnitt 5.6.3). Auÿerdem
ist nicht bekannt, ob die siRNA-Bindung mit einer 1:1 Stöchiometrie erfolgt oder ein
siRNA-Molekül durch zwei oder mehr hTRBP-His-Moleküle gebunden wird. In den Studien
von Yamashita et al. wurde beobachtet, dass Wildtyp-TRBP jeweils nur ein siRNA-Molekül
bindet, wohingegen einzelne Domänen oder Mutanten, in denen nur eine Bindedomäne funktionsfähig
war, jeweils mit zwei siRNAs assoziierten [204].
Die zweite beobachtbare Phase ist unabhängig von der Proteinkonzentration und repräsentiert
aller Wahrscheinlichkeit nach eine konformationelle Umlagerung von hTRBP-His, die
für die eektive siRNA-Bindung nötig ist. Die Assoziationsratenkonstante ist mit 2,6 s -1 relativ
schnell und deutlich höher als die Dissoziationsratenkonstante mit 0,15 s -1 , was die hohe
Anität unter Gleichgewichtsbedingungen erklärt. Da keine strukturellen Informationen
des vollständigen hTRBP oder eines homologen Proteins existieren, lassen sich keine genauen
Rückschlüsse darauf ziehen, in welchem Bereich des Proteins möglicherweise Umlagerungen
stattnden. Es existieren allerdings Röntgenkristall- und NMR-Strukturdaten der beiden
dsRNA-Bindemotive 1 und 2 von humanem TRBP [204, 268] sowie der dsRBM des homologen
Xlrbpa-2 aus X. laevis [210]. Die Überlagerung des hTRBP dsRBM 2 ohne Substrat und des
Xlrbpa-2 dsRBM im Komplex mit einer dsRNA zeigte, dass die Substratbindung innerhalb
der Bindedomäne nicht zu einer konformationellen Umlagerung führt [204]. Die geringe Flexibilität
ist bereits für andere dsRBPs beschrieben [269, 270]. Deshalb liegt die Vermutung nahe,
dass die Bewegung in den Proteinbereichen liegt, die die dsRBM miteinander verbinden. Sobald
ein Motiv Kontakt mit der dsRNA eingeht, wäre eine scharnierartige Bewegung denkbar,
so dass das zweite Motiv mit dem Substrat in Wechselwirkung treten kann. Dies könnte einen
Komplex zur Folge haben, bei dem das Protein zangenartig sein dsRNA-Substrat umfasst.
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