Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
unterschiedlicher Expressions- und Isolierungssysteme sowie die unter verschiedenen Proteinpräparationen
üblichen leichten Unterschiede zurückzuführen sein. Da mit verschiedenen
Substraten gearbeitet wurde, lässt sich auch ein Einuss der Sequenz, Länge oder Synthetisierung
nicht ausschlieÿen. Ein möglicher Einuss des 5'-terminalen Nukleotides kann allerdings
ausgeschlossen werden, da alle untersuchten Substrate an dieser Stelle ein U aufweisen [128].
Natürlich muss bei den Arbeiten von Tan et al. beachtet werden, dass die Daten mit murinem
statt humanem Ago2 erhoben wurden. Beide Proteine sind zu 99 % identisch [260].
K d (nM)
Protein
experimentelles System
Substrat
Referenz
7,1 bakteriell exprimiertes P-as2B-FAM (21 nt) Abschnitt 5.7.2
rekombinantes GST-hAgo2
83 in Sf9-Zellen exprimiertes 19-as (19 nt) [199]
rekombinantes GST-hAgo2
61 aus HeLa-Zellen immun- 19-as (19 nt) [199]
präzipitiertes HA-hAgo2
9,8 in Sf9-Zellen exprimiertes let-7a (22 nt) [260]
rekombinantes GST-mAgo2
Tabelle 6.1: Vergleich verschiedener Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für Komplexe aus humanem
(h) oder murinem (m) Ago2 und am 5'-Ende phosphorylierter einzelsträngiger guide RNA.
Eine feste Bindung der guide RNA durch hAgo2 scheint biologisch sinnvoll. Schlieÿlich ist
der programmierte RISC ein zum multiplen Umsatz fähiger Enzymkomplex [6163]. Nach
der Programmierung muss der guide Strang für die Erkennung und Bindung der target RNA
an hAgo2 gebunden bleiben. Auch nach ihrer Spaltung und der Produktfreisetzung müssen
hAgo2 und guide RNA assoziiert bleiben. Eine feste Assoziation der beiden Bindungspartner
ist bereits beobachtet worden. Weder unter Hochsalzbedingungen (2,5 M KCl oder 2,5 M NaCl)
noch bei der Verwendung von 1 M Harnsto konnte die Dissoziation des RISC und einer
gebundenen siRNA bewirkt werden [35, 168]. Weiterhin scheint es bisher unmöglich, einen
programmierten RISC durch eine kompetierende siRNA zu reprogrammieren [264, 265]. Ob
die Anwesenheit einer spezischen target RNA einen Einuss auf die siRNA-Bindung ausübt,
ist Gegenstand aktueller Forschung.
Die Entfernung der Phosphatgruppe am 5'-Ende der guide RNA führte zu einer signikant
verringerten Anität. Die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante für einen Komplex aus
GST-hAgo2 und OH-as2B-FAM ist um ein 15-faches geringer (K d = 106 nM) als für denjenigen
aus GST-hAgo2 und der sequenzidentischen P-as2B-FAM (K d = 7,1 nM). Dies bietet
eine Erklärung, warum die Spaltungsaktivität von Ago2 bei einer Programmierung mit un-
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