Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
hTRBP
H
A
kDa
Gesamtzelllysat
0 1 2
lösliche
Fraktion
unlösliche
Fraktion
0 1 2 0 1 2
h n.I.
B
kDa
-hTRBP
-His
130
95
130
95
72
72
55
55
43
43
Abbildung 5.5: Expression von hTRBP-His (siehe Abschnitt 4.3.6). Die Anzucht des Stamms
BL21(DE3)-pET41b(+)-hTRBP-His erfolgte in TFB-Medium bei 37 ◦ C für 4 h. E. coli Zellextrakte
wurden auf Anwesenheit des Zielproteins sowie seine Verteilung auf die lösliche und unlösliche Fraktion
untersucht. (A) Detektion von hTRBP-His durch Coomassie-Färbung. (B) Western-Analyse von
hTRBP-His mittels α-hTRBP- sowie α-His-Antikörper. Die Banden der Zielproteine sind mit einem
Pfeil gekennzeichnet. h n. I.: Stunden nach Induktion.
ternommen, den löslich exprimierten hTRBP-His-Anteil zu vergröÿern und im Anschluss eine
Reinigung des nativen Proteins durchführen zu können.
Dafür wurde der Stamm BL21(DE3)-pET41b(+)-hTRBP-His in TFB-Medium bei 37 ◦ C
kultiviert und die Proteinexpression für 4 h induziert. Nach zeitaufgelöster Analyse der fraktionierten
Zellextrakte zeigte sich, dass nach 1 h mehr als 50 % der Gesamt-hTRBP-His-Menge
in löslicher Form vorlag, wohingegen eine längere Induktionszeit insgesamt zwar mehr hTRBP-
His hervorbrachte, jedoch einen deutlich höheren unlöslichen Anteil. Damit wurden als optimale
Bedingungen für die Expression von hTRBP-His der Expressionsstamm bei 37 ◦ C in
TFB-Medium kultiviert und die Proteinexpression für 1 h induziert (siehe Abbildung 5.5).
Die hTRBP-Identität sowie die Integrität der Poly-His-Markierung wurden durch Western-
Analysen unter Verwendung von adäquaten Antikörpern und Gröÿenmarkern nachgewiesen
(siehe Abbildung 5.5 B).
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