Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
k = 0,0004 (± 0,00001) s -1 , die derjenigen der Gesamtreaktion (multiple turnover) entspricht.
Die Amplitude betrug 91,2 (± 1,8) %. Die Auswertung der Daten durch eine zweifach exponentielle
Gleichung führte zu zwei verschiedenen Ratenkonstanten, k 1 = 0,0040 (± 0,0027) s -1
mit einer Amplitude von 6,4 (± 3,6) % sowie k 2 = 0,0003 (± 0,00004) s -1 mit einer Amplitude
von 85,1 (± 3,7) %. Dieses Ergebnis deutet auf die Existenz einer burst Phase hin, wobei ihre
Amplitude auf Grund der geringen Konzentration initial gebildeter ternärer Komplexe klein
ist. Ihre Ratenkonstante würde die single turnover Reaktion repräsentieren. Allerdings muss
dieser Wert unter Vorbehalt betrachtet werden, da die Amplitude der burst Phase nahe der
Detektionsgrenze des experimentellen Systems liegt.
5.9.2 Vergleichende Analyse der target RNA-Spaltung bei Verwendung
unterschiedlicher siRNA-Substrate
In Abschnitt 5.7.2 wurde gezeigt, dass GST-hAgo2 neben der Bindung einer 5'-phosphorylierten
guide RNA auch in der Lage ist, unphosphorylierte guide RNA und doppelsträngige siRNA
zu binden. Im Folgenden wurde untersucht, ob eine target RNA-Spaltung bei Verwendung
dieser siRNA-Substrate stattndet.
Hierzu wurden Standard-Spaltungsassays durchgeführt, bei denen P-as2B, OH-as2B und
P-si2B in Kombination mit GST-hAgo2 verwendet wurden. Als Negativkontrollen dienten die
nicht zur target RNA komplementären siRNA-Substrate P-asLam, OH-asLam und P-siLam.
Aus Abbildung 5.37 A wird ersichtlich, dass neben der target RNA-Spaltung durch den binären
GST-hAgo2/P-as2B-Komplex auch Umsatz durch GST-hAgo2/OH-as2B und GST-hAgo2/Psi2B
stattndet.
Die Umsätze wurden gegen die Zeit aufgetragen und jeweils der maximale Umsatz sowie
die Ratenkonstante der Gesamtreaktion durch Angleichen der Daten an eine exponentielle
Gleichung ermittelt (siehe Abbildung 5.37 B). Die Reaktion ndet mit vergleichbarer Ratenkonstante
statt, unabhängig davon, mit welchem siRNA-Substrat GST-hAgo2 beladen wurde.
Dies deutet darauf hin, dass in allen drei Fällen die Spaltung nach dem gleichen Mechanismus
stattndet. Im Gegensatz dazu unterscheidet sich der maximale target RNA-Umsatz. Der Umsatz
durch GST-hAgo2/P-as2B ist mit 85,8 (± 3,8) % am gröÿten. Ohne die 5'-Phosphatgruppe
am guide Strang nimmt der maximale Umsatz im Vergleich zu GST-hAgo2/P-as2B um etwa
9 % auf 78,4 (± 6,3) % ab. Erstaunlicherweise gelang auch die Spaltung einer target RNA unter
Verwendung von P-si2B als siRNA-Substrat, wobei die Programmierung von rekombinantem
hAgo2 mit doppelsträngiger siRNA in einem in vitro Spaltungsansatz bisher als unmöglich
galt [35]. Der hier erzielte maximale target RNA-Umsatz beträgt 27,6 (± 3,0) % und liegt damit
um etwa 68 % niedriger als derjenige durch GST-hAgo2/P-as2B.
Um auszuschlieÿen, dass dieses Ergebnis durch eine möglicherweise unvollständige Hybridisierung
von P-as2B und s2B und damit durch die Anwesenheit von einzelsträngigem P-as2B im
Spaltungsansatz erzielt wurde, erfolgte die radioaktive 5'-Endmarkierung beider Einzelsträn-
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