Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
4.1.11 Kryokonservierung von E. coli Bakterienstämmen
E.coli Stämme wurden für die Lagerung über längere Zeiträume als Glyzerinkulturen konserviert.
Dazu wurde eine Einzelkolonie des gewünschten Stammes für ca. 16 h bei 37 ◦ C und
200 rpm in LB- oder TFB-Medium inkubiert. Die Zellsuspension wurde im Verhältnis 1:1 mit
sterilem 87 % (v/v) Glyzerin gemischt, aliquotiert und bei 80 ◦ C gelagert.
4.1.12 Bestimmung der Nukleotidsequenz von DNA
Für die Sequenzierung von Plasmidabschnitten wurde zunächst Plasmid-DNA aus E. coli
Stämmen gewonnen (siehe Abschnitt 4.1.2). Die Sequenzierung erfolgte nach Sanger [248].
Ähnlich wie bei der PCR wird hierbei DNA an einer einzelsträngigen Vorlage neu synthetisiert.
Zusätzlich zu den dNTPs sind in dem Ansatz noch Didesoxynukleotidtriphosphate
(ddNTPs) enthalten, welche zufällig eingebaut werden und zum Kettenabbruch führen. Die
vier ddNTPs sind mit Fluoreszenzfarbstoen markiert, die jeweils ein anderes Fluoreszenzmaximum
aufweisen und dadurch unterscheidbar sind.
Die Sequenzierung wurde mit Hilfe des BigDye R○ Terminator Cycle Sequencing Kit durchgeführt.
Für die Sequenzier-Reaktion wurden in 20 µl-Ansätzen ca. 1 µg Plasmid-DNA als
Vorlage mit 3 µl 5 × Puer, 2 µl BigDye und 1 µM Primer gemischt. Die Zielsequenz wurde
im Thermocycler vervielfältigt (siehe Tabelle 4.6) und anschlieÿend auf 100 µl mit H 2 O
expandiert. Die DNA wurde mit Hilfe von Ethanol präzipitiert (siehe Abschnitt 4.2.5) und
getrocknet. Die weitere Verarbeitung erfolgte auÿerhalb des Instituts für Molekulare Medizin
durch Mitarbeiter der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin des Universitätsklinikums
Schleswig-Holstein (UKSH). Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit dem Programm SeqMan
7.0.0.
Primer
Temperaturprol
pET41b fwd 96 ◦ C für 180 s
972 rev 24 Zyklen
1233 fwd 96 ◦ C für 20 s
1411 fwd 50 ◦ C für 20 s
1506 rev 60 ◦ C für 240 s
2316 fwd 4 ◦ C, ∞
2519 rev
pET41b rev T7 term
pET41b BlpI rev
Tabelle 4.6: Für die Sequenzierung von Klonen verwendete Primer sowie das Temperaturprol.
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