Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
perimentelle Ansätze gewählt, bei denen entweder der guide Strang oder die target RNA eine
Fluoreszenzmarkierung trug. Die Kombination dieser drei verschiedenen Strategien erlaubte
die Messung der Assoziations- sowie Dissoziationsratenkonstanten von ternären Komplexen.
Der binäre Komplex bindet seine komplementäre target RNA mit hoher Anität
Die Messung der Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für die Assemblierungsreaktion eines
binären hAgo2/guide RNA-Komplexes und seiner komplementären target RNA zeigte, dass
diese Bindung hoch an ist (K d = 0,18 nM). Demnach ist die Anität des binären Komplexes
zur komplementären target RNA um ein 40-faches gröÿer als die Anität von hAgo2 zu einer
kanonischen guide RNA (K d = 7,1 nM). Dies widerspricht den Ergebnissen von Lima et al.
(siehe Tabelle 6.4) [199]. Zwar unterschieden sich die Daten dieser Arbeit bereits um den
Faktor 15 mit den hier vorgestellten Ergebnissen, was die Anität von GST-hAgo2 zu einer
phosphorylierten guide RNA betrit, weshalb eine Abweichung beider Werte nicht unerwartet
ist. Jedoch scheint im Fall von Lima et al. die Bindung einer target RNA vergleichbarer Länge
durch einen binären Komplex geringer an als die Bindung einer kanonischen guide RNA
durch hAgo2.
K d (nM)
experimentelles System
binärer Komplex Substrat
Referenz
0,18 bakteriell exprimiertes s2B-BHQ (21 nt) Abschnitt 5.8.2
rekombinantes GST-hAgo2
und P-as2B-FAM (21 nt)
204 in Sf9-Zellen exprimiertes 19-s (19 nt) [199]
rekombinantes GST-hAgo2
und 19-as (19 nt)
104 in Sf9-Zellen exprimiertes 20-s (20 nt) [199]
rekombinantes GST-hAgo2
und 19-as (19 nt)
>10000 in Sf9-Zellen exprimiertes ohne Erkennungssequenz [199]
rekombinantes GST-hAgo2 (43 nt)
und 19-as (19 nt)
Tabelle 6.4: Vergleich verschiedener Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für Komplexe aus humanem
(h) Ago2 und am 5'-Ende phosphorylierter einzelsträngiger guide RNA sowie komplementärer
oder nicht-komplementärer target RNA.
Das verwendete experimentelle System enthält drei Komponenten (GST-hAgo2, P-as2B-
FAM und s2B-BHQ) und ist deshalb relativ komplex. Neben dem gewünschten Prozess, näm-
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