Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.8 Charakterisierung der target RNA-Bindung durch den binären hAgo2/guide RNA-Komplex
aus hAgo2 und guide RNA bei diesen Bedingungen wurde durch eine entsprechende stopped
ow Messung belegt, bei der 300 nM NHA-hAgo2 rasch mit 20 nM P-as2B-FAM in 1 × Ago-
Bindungspuer gemischt und die Signaländerung aufgezeichnet wurde. Es konnte eine dreiphasige
Bindungsreaktion beobachtet werden, deren Ratenkonstanten quasi identisch mit denjenigen
in Anwesenheit von MgCl 2 ermittelten waren (1 × Ago-Spaltungspuer mit 2 mM MgCl 2 :
k 1, obs = 24,3 (± 9,1) s -1 , k 2 = 0,26 (± 0,16) s -1 und k 3 = 0,0122 (± 0,0024) s -1 (siehe Abschnitt
5.7); 1 × Ago-Bindungspuer ohne MgCl 2 : k 1, obs = 25,4 (± 7,2) s -1 , k 2 = 0,11 (± 0,02) s -1 und
k 3 = 0,0124 (± 0,0007) s -1 ). Somit konnten Bedingungen gefunden werden, bei denen es zur Assemblierung
des ternären Komplexes ohne gleichzeitige Spaltung der target RNA kommt. Die
Studien zur Charakterisierung der Erkennung und Bindung von target RNA wurden folglich in
1 × Ago-Bindungspuer ohne Mg 2+ durchgeführt. Für die Bildung binärer Komplexe wurden
GST-hAgo2 und der jeweilige guide Strang (siehe Abbildung 5.31) verwendet.
5.8.2 Bestimmung der Anität des binären Komplexes zur target RNA
Für die Messung der Anität des binären Komplexes zur target RNA wurde mittels Gleichgewichts-Fluoreszenztitration
unter steady state Bedingungen die Dissoziationskonstante bestimmt.
Hierfür wurde das molecular beacon (siehe Abbildung 5.31 A) verwendet. Zunächst
wurden 20 nM P-as2B-FAM mit 600 nM GST-hAgo2 gemischt und bis zur Abnahme des Fluoreszenzsignals
um ca 25 % inkubiert, um die Bildung von binären Komplexen zu gewährleisten
(siehe Abschnitt 5.7.2). Danach wurde der binäre Komplex mit steigenden Konzentrationen
s2B-BHQ titriert. Durch den Einsatz des Fluoreszenzlöschers konnte hierbei eine Signaländerung
von annähernd 100 % erreicht werden. Durch mathematische Auswertung der
Titrationskurve mit Hilfe einer quadratischen Bindungsgleichung wurde eine Gleichgewichts-
Dissoziationskonstante von 0,18 (± 0,04) nM ermittelt (siehe Abbildung 5.32).
Die Wiederholung des Experiments mit einem binären Komplex aus 20 nM P-as2B-FAM und
1000 nM GST-hAgo2 brachte das gleiche Ergebnis. Auÿerdem wurde s2B-BHQ in Abwesenheit
von P-as2B-FAM mit GST-hAgo2 titriert, was keinen Einuss auf das Fluoreszenzsignal
ergab. Weiterhin wurde ein Hybrid aus P-as2B-FAM und s2B-BHQ mit steigenden Konzentrationen
GST-hAgo2 gemischt, was ebenfalls keine Signaländerung zur Folge hatte. Deshalb
ist davon auszugehen, dass überschüssiges Protein im Titrationsansatz keinen Einuss auf die
beobachtete Signaländerung besitzt.
Die Gleichgewichts-Fluoreszenztitration wurde in Abwesenheit von GST-hAgo2 wiederholt
und so die Anität der beiden komplementären Stränge P-as2B-FAM und s2B-BHQ zueinander
bestimmt. Der K d betrug 0,38 (± 0,13) nM. Da die beiden in An- bzw. Abwesenheit
von GST-hAgo2 ermittelten Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten einander gleichen, lässt
dies den Schluss zu, dass die Bindung hauptsächlich durch die Watson-Crick-Basenpaarung
der beiden RNAs vermittelt wird. Das Protein scheint nicht direkt an der Interaktion des
binären Komplexes mit der target RNA beteiligt zu sein. Da s2B-BHQ 21 nt lang ist, kann es
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