Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

elative Fluoreszenz
5.7 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hAgo2
Ratenkonstante betragen k 2 = 0,48 (± 0,23) s -1 und k 3 = 0,0282 (± 0,0184) s -1 (Mittelwerte aus
fünf unabhängigen Experimenten). Die Ratenkonstanten der Assoziation von NHA-hAgo2 mit
P-si2B-FAM sind demnach vergleichbar mit denen der Assoziation von NHA-hAgo2 und einer
einzelsträngigen guide RNA.
Im letzten Schritt wurde die Dissoziation des binären Komplexes aus NHA-hAgo2 und
P-si2B-FAM unter pre-steady state Bedingungen untersucht. Dazu wurde P-si2B-FAM aus
dem binären Komplex durch einen 100-fachen Überschuss nicht-markierter asLam verdrängt
und die zeitabhängige Änderung des Fluoreszenzsignals aufgezeichnet (siehe Abbildung 5.30).
Mit Hilfe einer dreifach exponentiellen Gleichung wurden für den Dissoziationsprozess als
Ratenkonstanten k -1 = 22,0 (± 3,7) s -1 , k -2 = 5,7 (± 2,7) s -1 und k -3 = 0,0058 (± 0,0003) s -1 bestimmt.
Sie wurden analog zum Zerfall eines Komplexes aus NHA-hAgo2 und einer guide
RNA (siehe oben) der Dissoziation des Kollisionskomplexes (k -1 ) und der konformationellen
Umlagerung von hAgo2 bei der Freisetzung der siRNA aus der Mid Bindetasche (k -2 ) bzw.
der PAZ Domäne (k -3 ) zugeordnet.
Die Ratenkonstanten k -1 und k -3 der Dissoziation sind zwischen dem binären Komplex
aus NHA-hAgo2 und guide RNA bzw. demjenigen aus NHA-hAgo2 und doppelsträngiger
siRNA vergleichbar. Für k -1 ist dies zu erwarten, da für den Zerfall des Kollisionskomplexes
unerheblich sein sollte, ob die siRNA einzel- oder doppelsträngig ist. Für k -3 ist diese Tatsache
ebenfalls erklärbar. Die PAZ Domäne besitzt eine Anität zu dem 2 nt langen Überhang, den
eine siRNA charakteristischerweise an ihrem 3'-Ende besitzt [121123, 125] und der bei den
zuvor untersuchten guide RNAs identisch ist. Deshalb ist eine Veränderung dieser Interaktion
nicht zu erwarten. Bei k -2 jedoch ist ein Unterschied um den Faktor 30 feststellbar. Bei der
NHA
hAgo2
1,02
1,08
1
1,04
1
0,96
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
0,98
0 200 400 600 800 1000
Zeit (s)
Abbildung 5.30: Pre-steady state Dissoziationskinetik von NHA-hAgo2 und siRNA (siehe Abschnitt
4.4.3). Stopped ow Messung des Zerfalls von einem Komplex aus 20 nM P-si2B-FAM
und 300 nM NHA-hAgo2 in Anwesenheit von 2000 nM asLam. Die Daten wurden mit einer dreifach
exponentiellen Gleichung ausgewertet und ergaben k -1 = 22,0 (± 3,7) s -1 , k -2 = 5,7 (± 2,7) s -1 und
k -3 = 0,0058 (± 0,0003) s -1 .
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