Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

A.1 Theoretische Grundlagen der biochemischen und biophysikalischen Methoden
A.1.2 Ermittlung von Dissoziationskonstanten durch
Verdrängungstitration unter steady state Bedingungen
Durch Verdrängungstitration kann die Anität eines Proteins zu einem Liganden bestimmt
werden, ohne dass die Bindungsreaktion ein messbares Signal hervorruft. Es muss die Dissoziationskonstante
für einen alternativen Liganden bekannt sein, der durch den neuen Liganden
aus einem vorgelegten Komplex verdrängt wird. Durch die Kompetition beider Liganden um
die Bindestelle des Proteins kann das Verhältnis zwischen freier und gesamter Komponente
sowie die zugehörigen Fluoreszenzsignale deniert werden. Daraus ergibt sich folgendes Modell,
auf Grund dessen das Programm Scientist eine Bestimmung der Anität eines Proteins
zu unmarkierter Nukleinsäure erlaubt:
Modell
Denitionen
IndVars: Ctot A Protein
DepVars: Af, Bf, AB, AC, Cf, F B markiertes Substrat
Params: Kd1, Kd2, Atot, Btot, Yb, Yab C unmarkiertes Substrat
AB = Af · Bf/Kd1 f freie Konzentration
AC = Af · Cf/Kd2 tot gesamte Konzentration
Atot = Af + AB + AC F Fluoreszenz
Btot = Bf + AB Kd1 K d von B
Ctot = Cf + AC Kd2 K d von C
0 < Af