Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittelten RNAi
tung können Abweichungen leicht durch die Verwendung verschiedener Systeme entstehen.
Brown et al. bedienten sich eines Komplexes in HeLa-Zellextrakt, den sie zuvor in vivo durch
Transfektion mit siRNA beluden. Dieser Komplex wurde als Holo-RISC bezeichnet [185].
Analog dazu verwendeten Haley und Zamore in vivo beladenen RISC im Lysat von D. melanogaster
Embryonen [63]. Martinez und Tuschl benutzten einen minimalen RISC aus HeLa-
Zellextrakt, der mit Hilfe von Biotin-markierter siRNA anitätsgereinigt worden war [168].
Mit dem gleichen System arbeiteten Ameres et al. [200]. Die Gruppe um Rivas verwendete in
E. coli Zellen rekombinant exprimiertes, anitätsgereinigtes GST-hAgo2 in Kombination mit
einzelsträngiger siRNA in einem reinen in vitro System. Dies bezeichneten sie als rekombinanten
RISC [62]. Bei den verschiedenen Systemen ist zu beachten, dass der jeweilige RISC mit
sehr hoher Wahrscheinlichkeit eine unterschiedliche Zusammensetzung besitzt. Bei Arbeiten
mit Zellextrakten muss davon ausgegangen werden, dass sich neben Ago weitere Komponenten
wie Dicer oder dsRNA-bindende Proteine, z. B. TRBP oder PACT, im Reaktionsansatz
benden. Auch bei Arbeiten mit immunopräzipitiertem oder anitätsgereinigtem Ago aus
Säuger- oder Insektenzellen ist die Wahrscheinlichkeit der Koisolierung anderer Komponenten
neben Ago sehr groÿ. Dies ist dadurch bedingt, dass hAgo2 mit einer Vielzahl an Proteinen
in direkte Wechselwirkung treten kann [85, 146152, 201, 202].
Martinez und Tuschl identizierten die Freisetzung der Spaltprodukte sowie konformationelle
Umlagerungen des RISC als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt [168]. Hierbei besteht
die Möglichkeit, dass für die Spaltproduktfreisetzung entweder ein Faktor für die Entwindung
der Stränge nötig ist, wie beispielsweise eine Helikase. Andererseits ist es vorstellbar, dass Ago
selbst in der Lage ist, die Spaltprodukte zu entlassen. Diese Betrachtungen berücksichtigen allerdings
nicht mögliche Eekte der target RNA-Zugänglichkeit [22]. Brown et al. untersuchten
den Einuss von An- bzw. Abwesenheit der spezischen target RNA innerhalb der Zelle. Sie
konnten weder einen signikanten Einuss auf die kinetischen Parameter des RISC noch die
Menge aktiver Komplexe in HeLa-Zellen beobachten. Weiterhin konnten sie zeigen, dass ein
programmierter RISC eine Halbwertszeit von zwei bis vier Tagen besitzt [185]. Die Gruppe um
Ameres zeigte, dass bei geringer Zugänglichkeit der Erkennungssequenz innerhalb der target
RNA unter multiple turnover Bedingungen die Spaltungsreaktion einen biphasischen Verlauf
nimmt. Die beobachtete burst Phase wird auf den Umsatz von target RNA innerhalb präassemblierter
Komplexe zurückgeführt (initiale single turnover Reaktion). Die folgende Phase
besitzt eine deutlich langsamere Rate und repräsentiert vermutlich die Reaktion unter Gleichgewichtsbedingungen,
deren limitierender Schritt die Freisetzung der Spaltprodukte aus dem
RISC darstellt [200].
27