Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.3 Expression von rekombinantem hAgo2 und hTRBP
bau von Protease-Schnittstellen die Möglichkeit geschaen, die Markierungen nach erfolgter
Reinigung zu entfernen. Abbildung 5.1 gibt einen Überblick über die verwendeten hAgo2-
Konstrukte.
5.3 Expression von rekombinantem hAgo2 und hTRBP 1
5.3.1 Expression von NHA-hAgo2, hAgo2-His und His-hAgo2
Die Expression von NHA-hAgo2, hAgo2-His und His-hAgo2 wurde, wie unter Abschnitt 4.3.6
beschrieben, durchgeführt. Nach der Zellernte wurde der Expressionserfolg mittels SDS-PAGE
und Coomassie-Färbung oder Western-Analyse überprüft sowie weiterhin untersucht, ob das
jeweilige Zielprotein in gelöster oder ungelöster Form vorlag.
Abbildungen 5.2 A, B und D zeigen die IPTG-abhängige Induktion der Expression aller drei
Fusionsproteine, wobei die vollständig translatierten Proteine ein apparentes Molekulargewicht
von über 95 kDa zeigen. Im Fall von hAgo2-His kommt es bereits vor Zugabe von IPTG zu
einer geringen Expression (siehe Abbildung 5.2 B). Bei allen Proteinen liegt nur ein minimaler
Teil in gelöster Form vor, während sich der überwiegende Anteil in der die ungelösten Proteine
enthaltenden Fraktion des E. coli Extraktes bendet.
Die Identität von hAgo2 sowie die Integrität der Markierungen wurden durch Western-
Analysen unter Verwendung von gegen hAgo2 oder HA bzw. Poly-His gerichteten Antikörpern
nachgewiesen (siehe Abbildung 5.2 A, B, C, E).
Durch Verwendung von Antikörpern, die den N-terminalen Bereich der Fusionsproteine
binden (siehe Abbildung 5.2 A, B, E) und damit auch Proteine detektieren, die C-terminal
verkürzt sind, zeigt sich ein charakteristisches Bandenmuster mit zahlreichen Proteinen höherer
elektrophoretischer Mobilität. Dieses tritt unabhängig davon auf, ob die Markierung oder
hAgo2 selbst durch den Antikörper detektiert wird und weist darauf hin, dass die Translation
nur zu einem mäÿigen Anteil vollständig abläuft. Wenn hingegen ein gegen den C-terminalen
Bereich gerichteter Antikörper verwendet wird (siehe Abbildung 5.2 C), zeigen sich neben einer
prominenten Bande auf Höhe des vollständig translatierten hAgo2-His nur wenige weitere
schwache Banden, die eventuell durch Protease-Abbau entstanden sind.
1 Die in Abschnitt 5.3 beschriebenen Experimente wurden teilweise in Zusammenarbeit mit S. Weiÿbach und
J. Blank im Rahmen der Betreuung ihrer Bachelorarbeiten sowie A. Roth im Rahmen der Betreuung ihres
studentischen Praktikums durchgeführt.
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