Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Mini-Präparation (kleiner Maÿstab)
Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wurde eine E. coli Kolonie von einer Agarplatte mit Selektionsantibiotikum
entnommen und in 4 ml antibiotikumhaltiges LB-Medium überführt. Die
Kultur wurde für 16 h bei 37 ◦ C und 200 rpm inkubiert. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte
mit dem GenElute Plasmid Miniprep Kit nach den Angaben des Herstellers. Konzentration
und Reinheit der Plasmid-DNA wurden wie unter Abschnitt 4.2.1 beschrieben bestimmt.
Maxi-Präparation (groÿer Maÿstab)
Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wurde eine E. coli Kolonie von einer Agarplatte mit
Selektionsantibiotikum entnommen und in 5 ml antibiotikumhaltiges LB-Medium überführt.
Die Vorkultur wurde für ca. 8 h bei 37 ◦ C und 200 rpm inkubiert. Anschlieÿend wurden 300 µl
der Vorkultur verwendet, um 300 ml LB-Medium anzuimpfen. Die Hauptkultur wurde für
ca. 16 h bei 37 ◦ C und 200 rpm inkubiert. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte mit dem
Nucleobond R○ Xtra Maxi Kit nach den Angaben des Herstellers. Konzentration und Reinheit
der Plasmid-DNA wurden wie unter Abschnitt 4.2.1 beschrieben bestimmt.
4.1.3 Gelelektrophorese zur Analyse von Nukleinsäuren
Agarose-Gelelektrophorese
Für die Auftrennung von langkettigen Nukleinsäuren wurde die Agarose-Gelelektrophorese
mit 1 × TAE (siehe Abschnitt 3.6) als Laufpuer eingesetzt. Die Prozentigkeit der Gele wurde
dabei in Abhängigkeit von der Gröÿe der zu analysierenden Nukleinsäuren mit 1 × TAE
eingestellt (siehe Tabelle 4.2).
Agarosekonzentration (%, w/v)
Nukleinsäurelänge (bp)
0,5 1.000 30.000
0,7 800 12.000
1,0 500 10.000
1,2 400 7.000
1,5 200 3.000
3,0 10 1.000
Tabelle 4.2: Agarosekonzentrationen für die Agarose-Gelelektrophorese in Abhängigkeit der Nukleinsäurelänge.
Die Proben wurden mit Ladepuer für Agarosegele (siehe Abschnitt 3.6) eingestellt. Die
elektrophoretische Auftrennung erfolgte je nach Menge der zu trennenden Nukleinsäuren unter
Verwendung von analytischen bzw. präparativen Kämmen in einer horizontalen Gelkammer
bei 10 V/cm Gellänge für 30 60 min. Zum Nachweis der Bandengröÿe wurde ein adäquater
52