Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.4 Präparation von rekombinantem hAgo2 und hTRBP
Um die Gröÿenauschlusschromatographie als Möglichkeit einer weiteren Reinigungsmethode
für hAgo2-His oder His-hAgo2 zu testen, wurde die Säule mit Rückfaltungspuer (siehe
Abschnitt 4.3.8) äquilibriert und zunächst mit 2 mg aus inclusion bodies isoliertem hAgo2-His
beladen. Das Chromatogramm (siehe Abbildung 5.8 A) zeigt einen maximalen Absorptionsanstieg
bei einer Retentionszeit von 15,4 min. Daraus lässt sich schlieÿen, dass hAgo2-His auf
Grund seiner Gröÿe nicht mit der Säulenmatrix interagiert hat und vermutlich stark aggregiert
vorliegt. Die einzelnen Fraktionen wurden elektrophoretisch aufgetrennt und die enthaltenen
Proteine durch Silbernitrat-Färbung detektiert. Zwar zeigt sich in Fraktion B, dass eine weniger
stark aggregierte hAgo2-His-Population eluiert werden konnte. Jedoch deutet der Vergleich
des Bandenmusters mit demjenigen der eingesetzten Proteinlösung auf keinen Reinigungseekt
hin.
In einem weiteren Experiment wurde aus inclusion bodies isoliertes His-hAgo2 eingesetzt,
das zuvor bei 150.000 × g und 4 ◦ C für 1 h zentrifugiert worden war, um groÿe Aggregate vor
der Beladung der Säule abzutrennen. So wurden bereits vor der Gröÿenausschlusschromatographie
etwa 50 % der eingesetzten 1,5 mg sedimentiert (siehe Abbildung 5.8 B). Von den
gesammelten Fraktionen wurden je 1,8 ml mit TCA gefällt, elektrophoretisch getrennt und
per Silbernitrat-Färbung detektiert. Es zeigt sich, dass ein groÿer Teil der Aggregate, die im
Fall von hAgo2-His nicht mit der Säulenmatrix interagiert hatten, durch die zuvor durchgeführte
Zentrifugation entfernt werden konnten. Allerdings konnte erneut kein zusätzlicher
Reinigungseekt für weniger stark aggregiertes His-hAgo2, welches eine längere Retentionszeit
aufwies (siehe Abbildung 5.8 B, Fraktionen B und C), erzielt werden.
Zusammen mit den Erkenntnissen der anitätschromatographischen Reinigungsexperimente,
also geringer Reinigungseekt und sehr schlechte Ausbeute, wurde entschieden, das aus
inclusion bodies isolierte, partiell gereinigte hAgo2-His und His-hAgo2 für weitere Studien zu
verwenden, für die der erreichte Reinheitsgrad genügte.
5.4.2 Entwicklung eines Reinigungsprotokolls für GST-hAgo2 und
GST-hAgo2-His unter nicht-denaturierenden Bedingungen
Parallel zu den Studien mit hAgo2-Konstrukten zu einer möglichen Reinigung unter denaturierenden
Bedingungen wurde mit GST-hAgo2 und GST-hAgo2-His an einer Lösung zur
Gewinnung von ausreichend groÿen Mengen (mehrere Milligramm) Protein gearbeitet. Die
beiden Konstrukte ermöglichen durch ihre GST-Markierung eine weitere anitätschromatographische
Strategie. Auÿerdem lag in beiden Fällen ein weitaus gröÿerer Anteil von hAgo2 in
gelöster Form im bakteriellen Extrakt vor als bei den anderen Konstrukten. Deshalb wurden
zunächst systematisch die Bedingungen für die anitätschromatographische Reinigung von
GST-hAgo2-His und GST-hAgo2 unter nicht-denaturierenden Bedingungen im analytischen
Maÿstab getestet.
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