Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

A Anhang
Bindungspartner miteinander zustande kommt, ist sie proportional zum Bindungsgrad, welcher
vom Verhältnis [AB] zu [B] 0 beschrieben wird. Unter sättigenden Bedingungen stellt die
maximale Fluoreszenzänderung ∆F max die Proportionalitätskonstante dar.
∆F = ∆F max · [AB]
[B] 0
(A.6)
mit ∆F = Änderung des Fluoreszenzsignals bei einem Titrationsschritt und ∆F max = maximale
Änderung des Fluoreszenzsignals.
Die pro Titrationsschritt erfasste Messgröÿe ist die Gesamtuoreszenz F. Sie setzt sich
zusammen aus der Grunduoreszenz des ungebundenen uoreszierenden Bindungspartners B
und der durch Zugabe des Bindungspartners A hervorgerufenen Fluoreszenzänderung ∆F.
Je nach Art der Wechselwirkung kann dies eine Signalab- oder zunahme sein. Im ersten Fall
entspricht die Grunduoreszenz von B der maximal gemessenen Fluoreszenz F max , im zweiten
der minimal gemessenen Fluoreszenz F 0 . Mathematisch ergibt sich also für eine Signalabnahme
und für eine Signalzunahme
F = F max − ∆F
F = F 0 + ∆F
(A.7)
(A.8)
Durch Kombination der Gleichungen A.7 bzw. A.8 mit A.6 und A.5 ergibt sich für die Gesamtuoreszenz
folgender Zusammenhang:
F = F max − (F max − F 0 ) ·
[A] 0 +[B] 0 +K d
2
−
√ (
[A] 0 +[B] 0 +K d
[B] 0
2
) 2
− [A] 0 · [B] 0
(A.9)
für eine Abnahme des Fluoreszenzsignls und
F = F 0 + (F max − F 0 ) ·
[A] 0 +[B] 0 +K d
2
−
√ (
[A] 0 +[B] 0 +K d
[B] 0
2
) 2
− [A] 0 · [B] 0
(A.10)
für eine Zunahme des Fluoreszenzsignals.
Durch Messung der Gesamtuoreszenz F nach jedem Titrationsschritt und Auftragung gegen
die Konzentration des Bindungspartners A ergibt sich eine Bindungskurve, die durch die
Annäherung der adäquaten quadratischen Gleichung A.9 oder A.10 mathematisch ausgewertet
werden kann.
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