Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...
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5 Ergebnisse<br />
5.1 Vorarbeiten zu diesem Dissertationsprojekt<br />
Grundlage für die im Rahmen dieser Dissertation geplanten Studien war ein bakterielles Expressionskonstrukt<br />
für rekombinantes NHA-hAgo2 (pET24(+)-NHA-hAgo2 im E. coli Stamm<br />
BL21(DE3)) sowie ein Protokoll zur Isolierung des Proteins aus inclusion bodies (Einschlusskörperchen)<br />
unter denaturierenden Bedingungen und seine anschlieÿende Rückfaltung. Beides<br />
wurde freundlicherweise von C. Geist (Institut für Molekulare Medizin, Universität zu Lübeck)<br />
zur Verfügung gestellt. Nach Durchführung von Expression, Isolierung und Rückfaltung<br />
lag partiell gereinigtes, in vitro enzymatisch aktives Protein im Milligramm-Maÿstab vor. Allerdings<br />
war <strong>der</strong> Reinheitsgrad des gewonnenen NHA-hAgo2 für die geplanten Studien nicht<br />
ausreichend hoch, da die Präparation eine groÿe Anzahl kürzerer Proteinfragmente aufwies,<br />
die sehr wahrscheinlich auf translationale Abbrüche während <strong>der</strong> Expression zurückzuführen<br />
sind (siehe Abschnitte 5.3.1 und 5.3.3).<br />
Somit wurden verschiedene Strategien zur Gewinnung einer ausreichend homogenen, enzymatisch<br />
aktiven und mengenmäÿig zufriedenstellenden Proteinpräparation verfolgt. Trotz<br />
aufwändiger Bemühungen ist bislang in <strong>der</strong> wissenschaftlichen Literatur die Expression und<br />
Aufreinigung von bakteriell exprimiertem, rekombinantem hAgo2, das <strong>der</strong>artigen Ansprüchen<br />
gerecht wird, nicht beschrieben.<br />
5.2 Strategien zur Gewinnung von rekombinantem hAgo2 für<br />
biochemische Studien<br />
Für die Entwicklung neuer Strategien zur Gewinnung von rekombinantem hAgo2 mussten zwei<br />
wesentliche Faktoren berücksichtigt werden: die schlechte Löslichkeit des Proteins während<br />
<strong>der</strong> Expression sowie die unvollständige Translation, die neben dem vollständig translatierten<br />
Protein jeweils eine Vielzahl weiterer, kürzerer Produkte hervorbrachte.<br />
Im ersten Fall war zwar ein Protokoll zur Isolierung von NHA-hAgo2 unter denaturierenden<br />
Bedingungen mit anschlieÿen<strong>der</strong> Rückfaltung etabliert, jedoch stellte dies keine ideale Voraussetzung<br />
für die im Rahmen des Dissertationsprojektes geplanten Studien dar. Zum Einen<br />
gibt es keine Möglichkeit festzustellen, wie ezient die Rückfaltung des mit 103,8 kDa relativ<br />
groÿen Proteins und somit wie groÿ <strong>der</strong> Anteil an inaktivem Enzym ist. Zum An<strong>der</strong>en konnte<br />
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