Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.2 Methoden im Umgang mit Nukleinsäuren
4.2.1 Quantizierung von Nukleinsäuren
4.2 Methoden im Umgang mit Nukleinsäuren
Die Konzentration von Nukleinsäuren in Lösung wurde photometrisch ermittelt. Die Absorption
bei 260 nm wurde mit den Spektrophotometern Nanodrop oder DU-640 gemessen. Daraus
wurde durch das Lambert-Beer'sche Gesetz die Konzentration (c) berechnet:
A 260 nm = ε · c · d ⇔ c = A 260 nm
ε · d
(4.1)
mit A 260 nm = Absorption, ε = molarer Extinktionskoezient (cm -1 M -1 ) und d = Schichtdicke
(cm). Für Oligonukleotide mit bekannter Sequenz wurde der molare Extinktionskoezient aus
der Summe der molaren Extinktionskoezienten der einzelnen Basen berechnet. Für Nukleinsäuren
mit unbekannter Sequenz wurde folgende Näherung verwendet:
A 260 nm = 1 entspricht 50 µg/ml dsDNA
A 260 nm = 1 entspricht 33 µg/ml ssDNA
A 260 nm = 1 entspricht 40 µg/ml RNA
Zusätzlich wurde das Verhältnis A 260 nm /A 280 nm berechnet, um die Reinheit der Präparation
zu überprüfen. RNA wurde bei einem Verhältnis von 1,9 2,1, DNA bei einem Verhältnis von
1,8 2,0 als ausreichend rein befunden.
4.2.2 Hybridisierung von Nukleinsäuren
Für die Generierung von doppelsträngiger siRNA wurden guide und passenger Strang miteinander
hybridisiert. Für die Modikation des Vektors pET41b (siehe Abschnitt 3.8.1) wurden
zwei komplementäre 120 nt lange DNA-Fragmente hybridisiert.
Es wurden äquimolare Mengen beider zu hybridisierender Nukleinsäure-Stränge für 5 min
bei 90 ◦ C und anschlieÿend für 1 h bei 37 ◦ C im jeweiligen 1 × Hybridisierungspuer (siehe
Abschnitt 3.6) inkubiert. Die Überprüfung auf vollständige Hybridisierung erfolgte mittels
nPAGE (siehe Abschnitt 4.1.3).
4.2.3 In vitro Transkription
Die bei Spaltungsassays (siehe Abschnitt 4.4.1) verwendete target RNA ICAM-1-IVT wurde
mittels in vitro Transkription hergestellt. Dabei diente das mit dem Restriktionsenzym NotI
linearisierte Plasmid pG-si2B(+) (siehe Abschnitt 4.1.6) als Vorlage für die T7 RNA Polymerase
zur Synthese eines 140 nt umfassenden Abschnitts des ICAM-1 Gens. Das Fragment
beinhaltet die zum guide Strang der siRNA si2B komplementäre Erkennungssequenz (siehe
3.8.3). Durch die Linearisierung erfolgte die Transkription durch die T7 RNA Polymerase vom
Promotor bis zur NotI-Schnittstelle.
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