Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

% Umsatz
5 Ergebnisse
wird, stehen diese kürzeren Versionen ebenfalls für die Spaltung durch hAgo2 zur Verfügung.
Auÿerdem kann das 9 nt lange Spaltprodukt degradiert werden. Das Spaltprodukt von 10 nt
Länge könnte durch eine unkorrekte Positionierung des guide Stranges innerhalb des aktiven
Komplexes zu erklären sein, wodurch sich ebenfalls die Spaltstelle verschieben würde.
Die Quantizierung des Umsatzes ergab sowohl einen Unterschied des maximalen Umsatzes
als auch der Geschwindigkeitsratenkonstante der Spaltungsreaktion (siehe Abbildung 5.48
B). In Abwesenheit von hTRBP-His beträgt der maximale Umsatz 25,6 (± 0,04) % und wird
durch denjenigen in Anwesenheit von hTRBP-His mit 41,2 (± 0,32) % um ein Drittel übertroen.
Die Geschwindigkeit der Reaktion wird um das 6-fache von 0,0002 (± 0,00006) s -1 auf
A
+ + + + + +
- - - - - -
+ + + + + +
+ + + + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
GST
+ +
+ +
+ +
- -
GST-hAgo2
hPACT-His
target RNA
siRNA
hAgo2
t (min)
IVT
(140 nt)
B
25
20
mit PACT
ohne PACT
15
10
5
5’-Spaltprodukt
(87 nt)
0
0 2000 4000 6000 8000
Abbildung 5.49: Einuss von hPACT-His auf die Spaltungsaktivität von GST-hAgo2 nach seiner
Programmierung mit doppelsträngiger siRNA (siehe Abschnitt 4.4.1). (A) Modizierter Spaltungsassay
mit 3,7 µM GST-hAgo2, 100 nM P-si2B und 2,5 nM ICAM-1-IVT. In einem Ansatz
erfolgte die Präinkubation von siRNA und 3,7 µM hPACT-His für 8 min bei 25 ◦ C, bevor target
RNA und GST-hAgo2 zugegeben wurden. Der andere Ansatz wurde in Abwesenheit von
hPACT-His präinkubiert. Es folgten eine Auftrennung durch denaturierende PAGE und Detektion
mittels Autoradiographie. Als Kontrolle wurde target RNA mit GST-hAgo2 und hPACT-
His gleichzeitig (Kontrolle 1) oder nur mit GST-hAgo2 (Kontrolle 2) ohne siRNA inkubiert. (B)
Die ermittelten Umsätze wurden gegen die Zeit aufgetragen und die korrespondierenden Raten
(k -hPACT-His = 0,0003 (± 6 × 10 -5 ) s -1 bzw. k +hPACT-His = 0,0006 (± 1 × 10 -4 ) s -1 ) und die maximalen
Umsätze (max. Umsatz -hPACT-His = 21,1 (± 1,87) % bzw. max. Umsatz +hPACT-His = 6,9 (± 0,46) %)
durch Anpassung der experimentellen Daten an eine einfach exponentielle Gleichung ermittelt. t: Zeit.
IVT: ICAM-1 in vitro Transkript als target RNA.
Zeit (s)
162