Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.4 Techniken zur biochemischen Charakterisierung von rekombinanten Proteinen
Daten angepasst, aus der sich die jeweilige Dissoziationskonstante ergab (siehe Anhang A.1.1).
Filterbindungsexperiment
Alternativ zur Ermittlung von K d s durch Gleichgewichts-Fluoreszenzspektroskopie wurde eine
Methode gewählt, die auf der nicht-kovalenten Bindung von Proteinen an Nitrocellulose-
Membranen basiert. Wenn man Protein-Nukleinsäure-Gemische auf die Membran gibt, so wird
Nukleinsäure, welche mit den Proteinen komplexiert ist, indirekt auf der Membran xiert und
kann nach Entfernung ungebundener Nukleinsäure quantiziert werden.
Hierfür wurden steigende Konzentrationen an GST-hAgo2 oder NHA-hAgo2 mit einer konstanten
Menge radioaktiv markierter Nukleinsäure (siehe Abschnitt 4.2.6) für 90 min bei 4 ◦ C
in Ago2-Spaltungspuer (im Fall von NHA-hAgo2: ohne KCl) inkubiert und anschlieÿend 10 µl
des Ansatzes auf einen im äquivalenten Puer äquilibrierten Nitrocelluloselter aufgetragen.
Der Filter wurde mit 2 ml Puer gewaschen, für 1 h bei 60 ◦ C getrocknet, in ein 5 ml Szintillationsgefäÿ
überführt und mit 3 ml Szintillationslösung überschichtet. Die Quantizierung der
Radioaktivität erfolgte mittels Flüssigszintillationsmessung für 1 min.
Zur Ermittlung der Nukleinsäuremenge, die ohne Anwesenheit von Protein am Filter haftet,
wurde ein Ansatz ohne Protein wie beschrieben mitgeführt. Für die Messung des maximalen
Signals wurde ein gleicher Ansatz auf einen Filter gegeben, jedoch nicht mit Puer gewaschen.
Die Filterbindungsexperimente wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Für die Bestimmung von Dissoziationskonstanten wurde der gebundene Anteil an Nukleinsäure
unter Berücksichtigung des Hintergrunds zum maximalen Signal ins Verhältnis gesetzt
und gegen die jeweilige Proteinkonzentration aufgetragen. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe
des Programms GraFit 5.0.6 analog zu den mittels Gleichgewichts-Fluoreszenzspektroskopie
gewonnenen Daten.
4.4.3 Charakterisierung von Nukleinsäurebindungsreaktionen mittels
transienter Fluoreszenzmessungen
Die Messung von Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten der Bindungsreaktion
von Nukleinsäuren an Proteine bei der Bildung eines binären Komplexes bzw. der
Bindungsreaktion einer target RNA an einen hAgo2/guide RNA-Komplex zur Entstehung eines
ternären Komplexes erfolgte vor der Einstellung des Reaktionsgleichgewichts. Mit Hilfe der
stopped ow Anlage SX20 (siehe Abbildung 4.2) wurden beide Bindungspartner sehr schnell
miteinander gemischt und die resultierende Komplexbildung beobachtet. Aus den experimentellen
Daten wurden Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten mathematisch ermittelt. Für die
Bestimmung von Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten wurde bei gleichzeitiger Verhinderung
der Reassoziation der Zerfall des Komplexes verfolgt. Die zeitabhängige Fluoreszenzänderung
wurde aufgezeichnet.
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