Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

elative Fluoreszenz
k 1, obs (s -1 )
5 Ergebnisse
und die im Überstand bendlichen Proteine zur Messung der Bindungskinetik verwendet.
Bestimmung der Assoziation und Dissoziation von dsRNA und hTRBP
Je 50 nM FAM-siLam wurden mit einer konstanten Konzentration hTRBP-His im Bereich von
100 800 nM mit Hilfe einer stopped ow Apparatur rasch gemischt und die Fluoreszenzänderung
aufgezeichnet. Für jede Proteinkonzentration wurden die Daten mathematisch mit Hilfe
einer exponentiellen Gleichung ausgewertet (siehe Abbildung 5.46 A).
Die Auswertung der experimentellen Daten durch eine zweifach exponentielle Gleichung
zeigte einen zweiphasigen Verlauf der Bindungsreaktion. Die erste schnelle Phase besitzt eine
Ratenkonstante pseudo-erster Ordnung (k 1, obs ). Die Ratenkonstanten wurden gegen die Proteinkonzentration
aufgetragen und aus dem linearen Zusammenhang (siehe Abbildung 5.46 B)
die Assoziationsratenkonstante der ersten Phase mit k 1 = 1,9 (± 0,04) × 10 8 M -1 s -1 ermittelt.
Die Bestimmung der Dissoziationsratenkonstante der ersten Phase ergab k -1 = 10,4 (± 2,0) s -1 .
Die zweite Ratenkonstante der Assoziation beträgt k 2 = 2,6 (± 1,2) s -1 (Mittelwert aus acht
unabhängigen Experimenten).
Bei der ersten Phase handelt es sich um einen konzentrationsabhängigen Prozess. Dies
impliziert, dass sie die diusionskontrollierte Bildung eines Kollisionskomplexes repräsentiert.
Die zweite Phase ist unabhängig von der hTRBP-His-Konzentration und beschreibt vermutlich
die konformationelle Umlagerung des Proteins während der siRNA-Bindung.
Im nächsten Schritt wurde die Dissoziation des Komplexes aus hTRBP-His und FAM-siLam
unter pre-steady state Bedingungen untersucht. Dazu wurde FAM-siLam durch schnelle Zu-
hTRBP
H
A
1,2
B
200
1
160
0,8
120
0,6
80
0,4
0,2
40
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Zeit (s)
0
0 200 400 600 800
hTRBP-His (nM)
Abbildung 5.46: Pre-steady state Assoziationskinetik von hTRBP-His und siRNA (siehe Abschnitt
4.4.3). (A) Repräsentative stopped ow Messung der Komplexbildung aus 50 nM FAM-siLam
und 300 nM hTRBP-His. Die Daten wurden mit einer zweifach exponentiellen Gleichung ausgewertet
und ergaben k 1, obs = 67,7 (± 0,61) s -1 und k 2 = 2,2 (± 0,13) s -1 . (B) Abhängigkeit von k 1, obs
u. a. aus (A) von der hTRBP-His-Konzentration. Es ergab sich k 1 = 1,9 (± 0,04) × 10 8 M -1 s -1 und
k -1 = 10,4 (± 2,0) s -1 .
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