Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2 Einleitung
rien besitzen mit dem Ago Protein die nötige molekulare Ausstattung der RNA-Interferenz,
wobei nicht geklärt ist, ob sie sich dieser tatsächlich bedienen [2628].
Alle genannten Organismen teilen die Grundzüge des Mechanismus, bei dem zunächst aus
langen doppelsträngigen RNA-Vorläufer-Molekülen durch ein Enzym aus der Dicer-Familie etwa
19 - 25 nt kurze dsRNAs generiert werden, die homologe Sequenzen zu den zu regulierenden
Genen aufweisen [29]. Bei Dicer handelt es sich um eine Typ III-RNase, die charakteristischerweise
Produkte mit Phosphatgruppen am 5'-Ende sowie 2 nt langen Überhängen am 3'-Ende
der beiden Einzelstränge und, auf Grund seiner intrinsischen Funktion als molekulares Lineal,
von weniger als 30 nt Länge generiert [3033]. Dicer liegt innerhalb einer Zelle im Komplex mit
einer Endonuklease aus der Argonaute Familie sowie einem dsRNA-bindenden Protein vor. In
menschlichen Zellen sind dies TAR RNA binding protein (TRBP) und/oder Protein kinase
R activator (PACT). Zusammen bilden sie den RISC loading complex (RLC) [34]. Dieser ist
verantwortlich für die eektive Übergabe der kleinen regulatorischen dsRNA auf die zentrale,
die katalytische Kompetenz bereitstellende Komponente des RISC, ein Protein aus der
Argonaute Familie [25, 35]. Für die eektive Programmierung des RISC muss der passenger
Strang entfernt werden. Dies erfolgt entweder durch das Entwinden des Hybrides oder Spaltung
mit anschlieÿender Degradation des passenger Stranges [36]. Nach der Erkennung und
Bindung der target mRNA wird ihre Translation verhindert, indem es entweder zum slicing, also
der guide RNA-vermittelten, sequenzspezischen Phosphodiesterhydrolyse der target RNA
mit anschlieÿender Degradation kommt oder alternativ die Bindung des Translationsapparates
durch sterische Blockierung verhindert wird. Die zweite Alternative kann durch Deadenylierung
und Abbau der cap Struktur begleitet werden, was wiederum zur Degradation der mRNA
führt [37].
Der genaue Mechanismus hängt neben dem Organismus in erster Linie von der Klasse der
kleinen, nicht-kodierenden RNA ab, die die target RNA-Erkennung vermittelt (siehe Abbildung
2.1). Im Folgenden werden die beiden wichtigsten Klassen kleiner regulatorischer RNAs
und ihre besonderen Merkmale bei der RNAi vorgestellt.
siRNA-vermittelte RNAi siRNAs wurden zunächst in Panzen entdeckt [38], später in
Fliegenembryonen und Würmern, denen zuvor lange dsRNA injiziert worden war [39] und in
Extrakten aus mit langen dsRNAs transzierten D. melanogaster S2 Zellen [40]. Die siRNAvermittelte
RNAi ist vor allem für Panzen und Pilze charakteristisch, existiert aber auch in
tierischen und menschlichen Zellen. Sie zeichnet sich dadurch aus, dass guide und passenger
Strang der siRNA perfekt komplementär zueinander sind. Die Quelle der Vorläufer-Moleküle
ist im Falle von exogener siRNA häug transgenen oder viralen Ursprungs bzw. durch Transfektion
künstlich in eine Zelle eingebracht [41]. Die seltener vorkommenden endogenen siRNAs
wurden zunächst in Panzen und C. elegans entdeckt [4244] und werden aus Vorläufer-
Molekülen gebildet, die durch Transposons und repetitive genetische Elemente entstehen [45].
Sie können entweder in cis oder in trans wirken (cis-acting (ca)siRNAs und trans-acting
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