Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
NHA
hAgo2
A
110
100
B
400
Rd R (nm)
90
80
70
60
50
Rd R (nm)
300
200
100
4°C
25°C
37°C
C
Rd (nm)
40
80
70
60
50
40
30
10 20 30 40 50
Temperatur (°C)
mit guide RNA
ohne guide RNA
20
0 20 40 60 80 100 120
Zeit (min)
D
rel. Rd
0
0 20 40 60 80 100 120
Zeit (min)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
NHA‐hAgo2
NHA‐hAgo2 + as2B
NHA‐hAgo2 + as2B + ICAM‐1‐IVT
NHA‐hAgo2 + ICAM‐1‐IVT
NHA‐hAgo2 + asLam
+ ICAM‐1‐IVT
0
0 10 20 30 40 50 60
Temperatur (°C)
Abbildung 5.17: Untersuchungen zum Aggregationsverhalten von enzymatisch aktivem NHA-hAgo2
(siehe Abschnitt 4.4.5). (A) Durchschnittliche Radien von NHA-hAgo2-Populationen einer 24,1 µM
Lösung in Rückfaltungspuer in Abhängigkeit der Temperatur. (B) Durchschnittliche Radien der Populationen
in Standard-Spaltungsassay-Ansätzen bei verschiedenen Temperaturen in Abhängigkeit der
Zeit. (C) Durchschnittliche Radien der Populationen in Standard-Spaltungsassay-Ansätzen bei 25 ◦ C
in An- und Abwesenheit von guide RNA in Abhängigkeit der Zeit. (D) Relative durchschnittliche
Radien der Populationen in Standard-Spaltungsassay-Ansätzen verschiedener Zusammensetzung in
Abhängigkeit der Temperatur. R d : durchschnittlicher Radius.
von Population 1 zu gröÿeren Radien von 17,2 21,4 nm (Population 1 * ). Vermutlich stellt
diese gröÿere Population den enzymatisch aktiven Komplex dar, da sie in Abwesenheit von
guide und target RNA nicht zu beobachten war. Der Massenanteil von Population 1 * betrug
93,2 99,8 %, war also gröÿer als derjenige von Population 1. Dies deutet darauf hin, dass
die Zusammenssetzung der NHA-hAgo2-Lösung auf einem dynamischen Gleichgewicht beruht
und Proteine aus multimeren Komplexen diundieren, die daraufhin für RNAi zur Verfügung
stehen.
Es wurde eine weitere Inkubation von NHA-hAgo2 und target RNA unter Bedingungen
eines Standard-Spaltungsassays bei 25 ◦ C in An- bzw. Abwesenheit der guide RNA durchgeführt.
Abbildung 5.17 C zeigt, dass in Anwesenheit der guide RNA die Zusammensetzung der
Populationen stabil bleibt, wohingegen es in Abwesenheit von guide RNA über die Zeit zu ei-
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