Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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mindestens drei Phasen mit sich unterscheidenden Geschwindigkeitsratenkonstanten durchläuft
(siehe Abschnitt 5.7.3). Die Assoziationsratenkonstante der ersten Phase ist abhängig
von der Konzentration des Proteins und stellt daher aller Wahrscheinlichkeit nach die diusionskontrollierte
Bildung eines initialen Kollisionskomplexes dar. Dabei ist es unerheblich, ob
die siRNA einzel- oder doppelsträngig ist oder sie eine Phosphatgruppe am 5'-Ende trägt. Der
einzige mögliche Grund für unterschiedliche Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten
besteht in einer unterschiedlichen Diusionsgeschwindigkeit der beteiligten Komponenten. Da
in allen drei Fällen hAgo2 einer der Bindepartner ist, müssen Unterschiede der Geschwindigkeitsratenkonstanten
demnach auf die siRNA-Substrate zurückzuführen sein. Die Assoziationsund
Dissoziationsratenkonstanten des ersten Bindungsschrittes für Komplexe aus GST-hAgo2
und P-as2B-FAM bzw. OH-as2B-FAM sind praktisch identisch. Im Fall von GST-hAgo2 und
der doppelsträngigen P-si2B-FAM verläuft die Assoziation und Dissoziation etwas schneller
(siehe Tabelle 5.2). Möglicherweise ndet deshalb die Diusion von P-si2B-FAM schneller statt
als bei den einzelsträngigen siRNA-Substraten.
Die zweite und dritte beobachtete Phase sind nicht von der Proteinkonzentration abhängig.
Deshalb ist anzunehmen, dass sie konformationelle Umlagerungen des Komplexes beschreiben,
die für die Beladung von hAgo2 notwendig sind. Für die Bindung einer guide DNA
durch T. thermophilus Ago sind dies die Verlängerung der basischen Bindungsfurche durch
eine Rotation der Mid Domäne sowie eine Drehung der PAZ Domäne, was in der Verengung
des Kanals und dadurch in einer festen Bindung des guide Stranges resultiert (siehe Abbildung
2.8) [28, 153]. Die Geschwindigkeitsratenkonstanten des zweiten Assoziationsschrittes
ähneln sich untereinander, im Gegensatz zu den entsprechenden Dissoziationsratenkonstanten,
die um den Faktor 10 voneinander abweichen (siehe Tabelle 5.2). Da sich die Substrate
P-as2B-FAM und OH-as2B-FAM nur durch die 5'-terminale Phosphatgruppe unterscheiden,
müssen unterschiedliche kinetische Parameter auf dieses Merkmal zurückzuführen sein. Da
die Phosphatgruppe für die Verankerung des guide Stranges in der Mid Bindetasche zuständig
ist (siehe Abbildung 2.5 B) [119], impliziert dies, dass die zweite Phase bei der hAgo2-
Beladung die Bindung des 5'-Endes des guide Stranges repräsentiert. Bei Abwesenheit der
kritischen Phosphatgruppe ist dieser Prozess erschwert, was zu einer beschleunigten Dissoziation
führt und unter Gleichgewichtsbedingungen in einer verminderten Anität resultiert.
Auch der Vergleich von Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten des zweiten Schrittes
von GST-hAgo im Komplex mit P-as2B-FAM bzw. P-si2B-FAM zeigt einen signikanten
Unterschied bei der Rückreaktion um den Faktor 30, während die Hinreaktion bei Bindung
einer einzel- oder doppelsträngigen siRNA vergleichbar schnell abläuft (siehe Tabelle 5.2).
Bei einer doppelsträngigen siRNA ist das 5'-terminale Nukleotid des guide Stranges mit dem
dritten Nukleotid des passenger Stranges gepaart. Es wäre zu erwarten, dass für die Verankerung
zum Einen Energie aufgewendet werden muss, um die Watson-Crick-Basenpaarung
aufzubrechen. Zum Anderen weist ein gebundener guide Strang einen Knick im Phosphat-
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