Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
NHA-hAgo2 nur in Anwesenheit von 500 mM L-Arginin zur Rückfaltung gebracht werden.
Verdünnung des Proteins und damit einhergehend des L-Arginins führte zur Präzipitation.
Im zweiten Fall waren im Vorfeld bereits Anstrengungen unternommen worden, um die
Expressionsbedingungen zu optimieren. Diese beinhalteten die Variation der IPTG-Konzentration,
Induktionszeit oder -temperatur oder die Expression des Konstruktes in den E. coli
Stämmen BL21(DE3)-Codon+RIL und Rosetta, die bezüglich der benötigten Codons eines
eukaryonten Gens optimiert sind. Die Maÿnahmen führten nicht zu einer verbesserten Translation.
Deshalb wurde ein neues Expressionssystem entwickelt.
Es wurden teilweise parallel vier Strategien verfolgt, um die ausgeführten Probleme zu überwinden.
Bei der ersten Strategie wurde ein hAgo2-Konstrukt verwendet, das am C-Terminus
eine Poly-His-Markierung trägt und sich somit die Möglichkeit erönete, mittels anitätschromatographischer
Reinigung nur vollständig translatierte Proteine zu isolieren. Der dafür
verwendete E. coli Stamm BL21(DE3)-pET41b(+)-hAgo2-His wurde freundlicherweise von
Dr. R. Kretschmer-Kazemi Far (Institut für Molekulare Medizin, Universität zu Lübeck) zur
Verfügung gestellt. Allerdings zeigte sich im Verlauf der Experimente, dass die Einführung
der C-terminalen Markierung zu einer signikanten Abnahme der enzymatischen Aktivität
von hAgo2 führte. Zur Verfolgung der zweiten Strategie wurde die Herstellung eines Plasmids
bei der Firma Qiagen in Auftrag gegeben, welches für hAgo2 kodiert und am N-Terminus eine
Poly-His-Markierung anfügt. Für eine verbesserte Translation wurde die Sequenz bezüglich
codon usage und GC-Gehalt optimiert, interne Poly-A-Stellen, Introns und splicing Stellen
entfernt und sich wiederholende Sequenzabschnitte, Instabilitätselemente sowie zu Sekundärstrukturen
der mRNA führende Bereiche vermindert. Bei der dritten und vierten Strategie
wurden Konstrukte entworfen und kloniert, die beide zur Löslichkeitserhöhung am N-Terminus
eine GST-Markierung trugen; bei Strategie drei wurde zusätzlich eine C-terminale Poly-His-
Markierung angefügt, um vollständig translatiertes Protein isolieren zu können. Bei Strategie
vier blieb der C-Terminus unmodiziert. Bei Strategien drei und vier wurde durch den Ein-
Bezeichnung schematische Darstellung Molekulargewicht
NHA‐hAgo2
NHA
hAgo2
103,8 kDa
hAgo2‐His
hAgo2
H
99 kDa
His‐hAgo2
H
hAgo2
98,5 kDa
GST‐hAgo2‐His
GST
hAgo2
H
125,9 kDa
GST‐hAgo2
GST
hAgo2
124,3 kDa
Abbildung 5.1: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten hAgo2-Fusionskonstrukte. Das jeweilige
Molekulargewicht ist angegeben. Grau: Kodierender Bereich. Weiÿ: Linker-Region. Hellblau:
TEV Protease-Schnittstelle. Ocker: Thrombin-Schnittstelle.
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