Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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der Gelverzögerungs-Analysen und der Vergleich der Chromatogramme von hTRBP-His allein
oder im Komplex mit siRNA implizieren demnach, dass die Substratbindung durch multimeres
hTRBP-His erfolgen kann.
Untersuchung mittels Fraktionierung und SDS-PAGE
Um nähere Informationen über die Zusammensetzung der hTRBP-His-Lösung sowie die Gröÿe
und den Anteil der einzelnen Populationen zu erhalten, wurde eine Fraktionierung durch
Zentrifugation vorgenommen wie unter Abschnitt 4.4.5 beschrieben.
Auf Grund der unterschiedlichen Sedimentationskoezienten der Populationen werden bei
einer Zentrifugation mit 20.000 × g Multimere mit einem Radius gröÿer 250 nm sedimentiert;
kleinere Multimere verbleiben im Überstand. Wenn man eine Zentrifugalkraft von 150.000 × g
anlegt, kommt es zur Sedimentation aller Multimere mit einem Radius gröÿer 50 nm. Die
Überstände wurden abgenommen und die Sedimente im adäquaten Volumen Ladepuer für
SDS-PAGE gelöst. Die Analyse aller Fraktionen erfolgte durch SDS-Gelelektrophorese mit
anschlieÿender Coomassie-Färbung. Die Banden wurden quantiziert und daraus die Gröÿe
der Populationen sowie deren Verteilung abgeschätzt (siehe Abbildung 5.20).
Es zeigt sich, dass ca. ein Drittel der hTRBP-His-Moleküle in Populationen vorliegen, deren
Radien 250 nm überschreiten. Diesen Anteil kann man als aggregiert betrachten und ob er
funktionelles hTRBP-His beinhaltet, ist fraglich. Ein Viertel der Populationen haben einen
Radius kleiner als 50 nm. Eventuell bildet Protein aus dieser Fraktion mit siRNA Komplexe,
die in Gelverzögerungs-Analysen als distinkte Banden erkennbar sind (siehe Abbildung 5.18
A). Diejenigen Komplexe, deren Gröÿe die Porenweite des nicht-denaturierenden PAA-Gels
überschreiten, werden möglicherweise unter Verwendung der dritten Population gebildet, deren
Radien im Bereich von 50 250 nm liegen.
hTRBP
H
A
kDa
55
43
K
ÜS
P ÜS P
B
0-50 nm 50-250 nm >250 nm
33% 25%
Abbildung 5.20: Zusammensetzung einer 12,14µM hTRBP-His-Lösung (siehe Abschnitt 4.4.5). (A)
SDS-PAGE-Analyse einer hTRBP-His-Lösung vor Zentrifugation (K) sowie jeweils Überstand (ÜS)
und solubilisiertes Sediment (P) nach Zentrifugation für 1 h bei 4 ◦ C und 20.000 × g bzw. 150.000 × g.
Detektion mittels Coomassie-Färbung. (B) Darstellung des prozentualen Anteils an Populationen mit
einem Radius kleiner 50 nm, 50 250 nm und gröÿer 250 nm.
42%
120