Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

elative Fluoreszenz
k 1, obs (s -1 )
5 Ergebnisse
Oligomeren kommt (siehe Abschnitt 5.5.5), die eventuell die guide RNA binden, aber eben
sehr langsam diundieren. Es kann auÿerdem nicht ausgeschlossen werden, dass bei der Bindung
eines siRNA-Substrates durch hAgo2 weitere konformationelle Änderungen stattnden,
deren Ratenkonstanten mit dem gewählten System nicht beobachtbar sind. Nach Gleichung
5.1 würden unbekannte Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten in den berechneten
K d eingehen, was die Dierenz der beiden Werte erklären kann.
Untersuchung der Assoziation und Dissoziation von dsRNA und hAgo2
Analog zu den Studien der Komplexbildung von NHA-hAgo2 und einzelsträngigen guide RNAs
wurde im Folgenden die Bildung eines binären Komplexes aus NHA-hAgo2 und P-si2B-FAM
zeitaufgelöst untersucht (siehe Abbildung 5.29 A). Die Signalabnahme war bei der Bildung
dieses Komplexes deutlich geringer als während der Bildung des binären Komplexes mit einzelsträngigen
guide RNAs. Wegen der geringen Amplitude und dem kleinen Signal-zu-Rausch-
Verhältnis weisen die ermittelten Werte einen gröÿeren Fehler auf.
Die Auswertung der experimentellen Daten durch eine dreifach exponentielle Gleichung
zeigte den bereits beobachteten dreiphasigen Verlauf der Bindungsreaktion. Die erste schnelle
Phase (siehe Abbildung 5.29 A, Darstellung bis 1 s) besitzt eine Ratenkonstante pseudo-erster
Ordnung (k 1, obs ). Die Ratenkonstanten wurden gegen die Proteinkonzentration aufgetragen
und aus dem linearen Zusammenhang (siehe Abbildung 5.29 B) die Assoziationsratenkonstante
der ersten Phase mit k 1 = 1,2 (± 0,13) × 10 8 M -1 s -1 ermittelt. Die Bestimmung der Dissoziationsratenkonstante
der ersten Phase ergab k -1 = 55,8 (± 6,9) s -1 . Die zweite und dritte
NHA
hAgo2
A
1,06
1,06
1,04
B
150
1,04
1,02
1
1,02
0,98
0,96
100
0,94
1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
50
0,98
0,96
0 200 400 600 800 1000
Zeit (s)
0
0 200 400 600 800
NHA-hAgo2 (nM)
Abbildung 5.29: Pre-steady state Assoziationskinetik von NHA-hAgo2 und siRNA (siehe Abschnitt
4.4.3). (A) Repräsentative stopped ow Messung der Komplexbildung aus 20 nM P-si2B-
FAM und 600 nM NHA-hAgo2. Die Daten wurden mit einer dreifach exponentiellen Gleichung ausgewertet
und ergaben k 1, obs = 126,0 (± 34,7) s -1 , k 2 = 0,69 (± 0,17) s -1 und k 3 = 0,0437 (± 0,0145) s -1 .
(B) Abhängigkeit von k 1, obs u. a. aus (A) von der NHA-hAgo2-Konzentration. Es ergab sich
k 1 = 1,2 (± 0,13) × 10 8 M -1 s -1 und k -1 = 55,8 (± 6,9) s -1 .
132