Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
5.4.3 Entwicklung eines Reinigungsprotokolls für hTRBP-His unter
nicht-denaturierenden Bedingungen
Nach der erfolgreichen Etablierung eines hTRBP-His-Expressionssystems zur Gewinnung von
gröÿtmöglichen Mengen an löslichem Protein (siehe Abschnitt 5.3.4) wurde eine anitätschromatographische
Reinigung von hTRBP-His unter nicht-denaturierenden Bedingungen im
präparativen Maÿstab durchgeführt. Dabei erwies sich der Umgang mit diesem Protein als
wesentlich einfacher als mit den unterschiedlichen hAgo2-Konstrukten.
In einem ersten experimentellen Ansatz wurden ca. 8 g BL21(DE3)-pET41b(+)-hTRBP-His
Bakterienzellen aufgeschlossen und die Proteinreinigung, wie unter Abschnitt 4.3.8 beschrieben,
mit folgender Ausnahme durchgeführt. Statt Elution durch einen linearen Imidazolgradienten
von 5 200 mM über 50 min wurde nach dem Waschen der Säule in Anwesenheit von
5 mM Imidazol die Elution durch Erhöhung auf 200 mM Imidazol ohne Gradienten durchgeführt
(siehe Abbildung 5.11 A). Zur Entfernung von verunreinigenden Proteinen wurden die
hTRBP
H
A
kDa
72
55
43
34
26
17
B
kDa
72
55
43
34
26
17
Abbildung 5.11: Anitätschromatographische Reinigung von hTRBP-His im präparativen Maÿstab
(siehe Abschnitt 4.3.8). (A) Reinigung ohne Gradientenelution. Detektion durch Coomassie-Färbung.
(B) Reinigung mit Gradientenelution. Detektion durch Coomassie-Färbung. Die Banden der Zielproteine
sind mit einem Pfeil gekennzeichnet.
104