Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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Oligomerisierungszustand von hTRBP abhängig von seiner Konzentration ist [204]. Zusammenfassend
ist festzuhalten, dass hTRBP-His scheinbar in mono- und multimeren Zuständen
in Lösung vorliegt. Interessanterweise scheint seine siRNA-Bindungseigenschaft weitgehend
unabhängig von der Gröÿe dieser Proteinkomplexe zu sein.
5.7 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hAgo2
5.7.1 Auswahl geeigneter siRNA-Substrate
Bei der siRNA-vermittelten RNA-Interferenz kommt es initial zur Bildung eines Komplexes,
der minimal aus Argonaute2 und einer guide RNA besteht. Für das Verständnis des Gesamtprozesses
ist es elementar, diesen primären Schritt möglichst detailliert zu untersuchen.
Als Modellsystem bieten in vitro Studien mit rekombinantem Protein und einer geeigneten
Nukleinsäure hierzu die Möglichkeit.
In der Literatur ndet sich ein Paradoxon bezüglich der siRNA, mit der Ago2 beladen
werden kann. Innerhalb der Zelle ist der guide Strang mit dem passenger Strang zu einer
doppelsträngigen siRNA hybridisiert, da die siRNA auf endogenem Weg aus einem langen
doppelsträngigen siRNA-Vorläufer generiert [29] bzw. als Doppelstrang transziert wird. Sie
wird mit Hilfe des RLC in Ago2 geladen, wobei die molekularen Details dieses Prozesses nicht
bekannt sind. Dabei ist auch nicht geklärt, ob der guide Strang allein an Ago2 übergeben
und der passenger Strang durch einen von Spaltung unabhängigen Prozess freigesetzt wird.
Alternativ könnte auch der Doppelstrang geladen werden, was die Spaltung und Freisetzung
des passenger Stranges zur Folge haben müsste, um einen katalytisch kompetenten RISC zu
erzeugen [36]. In vitro konnte bisher nicht gezeigt werden, dass mit doppelsträngiger siRNA
beladenes Ago2 Spaltungsaktivität aufweist [35]. Dies gelang nur nach Beladung mit einem
guide Strang [35, 199]. Weiterhin ist bekannt, dass das 5'-Ende des guide Stranges präferentiell
phosphoryliert vorliegen muss, um eine eektive Bindung durch Ago2 zu gewährleisten [199].
Der Umsatz einer target RNA bei Verwendung eines nicht-phosphorylierten guide Stranges ist
gegenüber demjenigen mit 5'-phosphoryliertem guide Strang deutlich vermindert [35, 199].
Aus diesen Gründen wurden drei uoreszenzmarkierte siRNA-Substrate ausgewählt, die
vergleichende Untersuchungen zur Substratanität und der Bildung von binären Komplexen
ermöglichen (siehe Abbildung 5.22). Der am 5'-Ende phosphorylierte guide Strang wird im
Folgenden als P-as2B-FAM bezeichnet, derjenige ohne Phosphatgruppe für eine eindeutige
Zuordnung als OH-as2B-FAM. Beim Hybrid aus P-as2B-FAM und dem nicht-phosphorylierten
und unmarkierten passenger Strang s2B wird im Folgenden von P-si2B-FAM gesprochen.
Die Position des Fluorophors wurde auf Basis der Röntgenstrukturdaten archaebakterieller
Argonaute Proteine (siehe Abschnitte 2.3 und 2.4) derart gewählt, dass eine Interferenz des
Fluorophors mit den beiden RNA-Bindetaschen in der Mid bzw. der PAZ Domäne von hAgo2
[28] oder des aktiven Zentrums in der PIWI Domäne [119] vermieden wird.
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