Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Die in vitro Transkription wurde unter RNase-freien Bedingungen durchgeführt. Ein Standard-Reaktionsansatz
setzte sich aus 1 × Transkriptionspuer, 1 µg linearisiertem Plasmid,
2 mM pro NTP, 0,8 u/µl RiboLock RNase Inhibitor und 0,2 u/µl T7 RNA Polymerase zusammen.
Der Ansatz wurde 30 min bei 37 ◦ C inkubiert und anschlieÿend um 0,2 u/µl DNaseI ergänzt.
Nach einer weiteren Inkubation für 15 min bei 37 ◦ C wurden nicht inkorporierte NTPs
durch Gelltration mit einer Sephadex-G-50 Säule nach Herstellerangaben abgetrennt. Das
in vitro Transkript wurde durch Phenol/Chloroform extrahiert (siehe Abschnitt 4.2.4), mit
Ethanol gefällt (siehe Abschnitt 4.2.5) und das Präzipitat in H 2 O aufgenommen. Es folgte
eine Überprüfung der Transkriptlänge mittels Agarose-Gelelektrophorese oder dPAGE (siehe
Abschnitt 4.1.3) und die Quantizierung sowie Bestimmung des Reinheitsgrades (siehe Abschnitt
4.2.1). Bis zu seiner weiteren Verwendung wurde das in vitro Transkript bei 20 ◦ C
gelagert.
4.2.4 Isolierung von Nukleinsäuren durch Phenol/Chloroform-Extraktion
Durch die Phenol/Chloroform-Extraktion können Nukleinsäuren aus proteinhaltigen wässrigen
Lösungen isoliert werden. Proteine werden durch Phenol denaturiert und sammeln sich
in der Interphase zwischen der hydrophoben Phenol- und der wässrigen Phase. Phenolreste
werden durch Waschen mit Chloroform/Isoamylalkohol-Gemisch entfernt. Für die Extraktion
von DNA wurde Phenol mit einem pH-Wert von 7,5 8,0 verwendet, für RNA lag der pH-Wert
zwischen 4,5 5,0.
Die zu isolierende Nukleinsäure wurde mit gleichem Volumen eines Gemisches aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
(25:24:1 v/v) versetzt, kräftig geschüttelt und für 1 min bei
20.000 × g zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen, 2 × mit gleichem Volumen
Chloroform/Isoamylalkohol (24:1 v/v) gewaschen und je 2 min bei 20.000 × g und Raumtemperatur
bis zur Phasentrennung zentrifugiert. Anschlieÿend wurde die Nukleinsäure enthaltende
wässrige Phase einer Ethanolpräzipitation unterzogen (siehe Abschnitt 4.2.5).
4.2.5 Präzipitation von Nukleinsäuren
Ethanolpräzipitation
In Gegenwart monovalenter Kationen und im leicht sauren pH-Bereich bilden Nukleinsäuren
in Ethanol einen nicht löslichen Niederschlag, der durch Zentrifugation isoliert werden kann.
Eine wässrige Nukleinsäure-Lösung wurde mit 300 mM NaCH 3 COOH pH 4,8 5,2 angesäuert
und in Anwesenheit von 0,05 mg/ml Glycogen als Fällhilfe mit dem 2,5 3 × Volumen
100 % (v/v) Ethanol versetzt. Es folgte eine Inkubation für 1 24 h bei 20 ◦ C oder 80 ◦ C.
Die präzipitierte Nukleinsäure wurde durch Zentrifugation für 1 h bei 20.000 × g und 4 ◦ C sedimentiert,
2 × mit eiskaltem 70 % (v/v) Ethanol gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet
und in einem beliebigen Volumen H 2 O oder 10 mM Tris pH 7,5 aufgenommen. Die Konzen-
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