Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

elative Fluoreszenz
relative Fluoreszenz
5 Ergebnisse
keine Auswirkung auf die Anzahl und die Geschwindigkeit der Phasen der Assoziation besitzt.
Dieses Ergebnis konnte mit den Substraten 19mer-FAM und sLam-Alexa488 bestätigt werden.
Im nächsten Schritt wurde die Dissoziation des binären Komplexes aus NHA-hAgo2 und P-
as2B-FAM bzw. OH-as2B-FAM unter pre-steady state Bedingungen untersucht. Zwar konnte
für die erste Phase bereits k -1 indirekt ermittelt werden, jedoch wurden die Daten durch ein
Experiment bestätigt, bei dem zeitaufgelöst die Verdrängung von as2B-FAM aus dem binären
Komplex durch einen 100-fachen Überschuss nicht-markierter asLam beobachtet wurde (siehe
Abbildung 5.28).
Zunächst fällt auf, dass die durch Verdrängung hervorgerufene Signalzunahme in beiden
Fällen deutlich geringer ist als die Abnahme während der Bildung des binären Komplexes.
Dies spricht dafür, dass nur etwa 20 % von P-as2B-FAM bzw. OH-as2B-FAM verdrängt werden
können. Durch die geringere Amplitude ist das Signal-zu-Rausch-Verhältnis kleiner als bei der
Beobachtung der Assoziation und die ermittelten Werte weisen einen gröÿeren Fehler auf.
Allerdings war die Güte der Daten ausreichend für eine mathematische Auswertung.
Es zeigte sich, dass auch die Dissoziation mindestens ein dreiphasiger Prozess ist. Durch Auswertung
der experimentellen Daten mit einer dreifach exponentiellen Gleichung ergaben sich
k -1 = 14,7 (± 2,5) s -1 , k -2 = 0,17 (± 0,02) s -1 und k -3 = 0,0066 (± 0,0001) s -1 für den Zerfall eines
NHA-hAgo2/P-as2B-FAM-Komplexes. Für die Dissoziation von NHA-hAgo2 und OH-as2B-
FAM wurden als Ratenkonstanten k -1 = 10,9 (± 15,9) s -1 , k -2 = 1,7 (± 0,3) s -1 und k -3 = 0,0094
NHA
hAgo2
A
1,02
B
1,06
1,04
1,01
1,04
1,02
1,02
1,08
1,04
1
1
1
0,98
1
0,96
0,96
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
0,92
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
0,99
0 200 400 600 800 1000
Zeit (s)
0,98
0 200 400 600 800 1000
Zeit (s)
Abbildung 5.28: Pre-steady state Dissoziationskinetik von NHA-hAgo2 und 5'-phosphorylierter versus
unphosphorylierter guide RNA (siehe Abschnitt 4.4.3). (A) Stopped ow Messung des Zerfalls
von einem Komplex aus 20 nM P-as2B-FAM und 300 nM NHA-hAgo2 in Anwesenheit von 2000 nM
asLam. Die Daten wurden mit einer dreifach exponentiellen Gleichung ausgewertet und ergaben
k -1 = 14,7 (± 2,5) s -1 , k -2 = 0,17 (± 0,02) s -1 und k -3 = 0,0066 (± 0,0001) s -1 . (B) Stopped ow Messung
des Zerfalls von einem Komplex aus 20 nM OH-as2B-FAM und 300 nM NHA-hAgo2 in Anwesenheit
von 2000 nM asLam. Die Daten wurden mit einer dreifach exponentiellen Gleichung ausgewertet und
ergaben k -1 = 10,9 (± 15,9) s -1 , k -2 = 1,7 (± 0,28) s -1 und k -3 = 0,0094 (± 0,0004) s -1 .
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