Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
weiterhin kleiner als diejenige für den Komplex aus GST-hAgo2 und der unphosphorylierten
einzelsträngigen OH-as2B-FAM. Dieses Ergebnis impliziert, dass die Beladung von rekombinantem
hAgo2 in vitro entgegen der bisher gängigen Meinung doch möglich ist.
Bislang existieren nur wenige Daten zur Anität von hAgo2 zu einem doppelsträngigen
siRNA-Substrat. Lima et al. untersuchten die Anität von GST-hAgo2 zu einem doppelsträngigen
19-mer (siehe Tabelle 6.3), allerdings wies das verwendete Substrat keine Überhänge
am 3'-Ende auf [199]. Da die PAZ Domäne genau jene Überhänge bevorzugt bindet
[121123, 125], scheint die geringe Anität für dieses Substrat nicht überraschend. Der in
dieser Arbeit ermittelte Wert zeigt die Bedeutung der 2 nt langen Überhänge an den 3'-Enden
einer siRNA.
K d (nM)
Protein
experimentelles System
Substrat
Referenz
47,9 bakteriell exprimiertes P-si2B-FAM (21 nt) Abschnitt 5.7.2
rekombinantes GST-hAgo2
6297 in Sf9-Zellen exprimiertes 19-as/19-s (19 nt) [199]
rekombinantes GST-hAgo2
>1000 aus HeLa-Zellen immun- 19-as/19-s (19 nt) [199]
präzipitiertes HA-hAgo2
Tabelle 6.3: Vergleich verschiedener Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für Komplexe aus humanem
(h) Ago2 und doppelsträngiger phosphorylierter siRNA.
Da die Beladung des RISC innerhalb der Zelle durch eine doppelsträngige siRNA erfolgt,
hAgo2 in vitro jedoch eine Präferenz für einzelsträngige RNA zeigt [35, 199, 200], muss vermutet
werden, dass ein bisher nicht identizierter Faktor existiert, der die in vivo Beladung
erleichtert. Es ist denkbar, dass diese Aufgabe durch dsRNA-bindende Proteine wie PACT
und TRBP wahrgenommen wird. Da TRBP Teil des RLC ist, wird bereits seit einiger Zeit
eine mögliche Funktion bei der Übergabe einer durch Dicer prozessierten doppelsträngigen
siRNA an hAgo2 diskutiert [34, 238, 256].
Die eektive hAgo2-Beladung erfordert die Verankerung des guide
Strang-5'-Endes
Neben einer vergleichenden Analyse der Substratbindungsparameter unter Gleichgewichtsbedingungen
können auch pre-steady state Untersuchungen Aufschluss über den Mechanismus
der hAgo2-Beladung liefern. Nach eigenem Kenntnisstand stellt diese Arbeit die ersten transientenkinetischen
Analysen der siRNA-Bindung durch rekombinantes humanes Ago2 vor.
Die Beladung von hAgo2 durch einzel- oder doppelsträngige siRNA ist ein Prozess, der
175