Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
schwache Absorption aufweisen, wird dies bei der Berechnung des molaren Extinktionskoezienten
bei 205 nm berücksichtigt:
ε 205 nm = 27 + 120 · A280 nm
A 205 nm
(4.4)
mit ε 205 nm = molarer Extinktionskoefzient bei 205 nm (cm -1 mg/ml) und A 280 nm/205 nm = jeweilige
Absorption. Nach der Messung der Absorption bei 205 nm und der Bestimmung des
molaren Extinktionskoezient bei 205 nm wurde die Konzentration gemäÿ dem modizierten
Lambert-Beer'schen Gesetz berechnet:
A 205 nm = ε 205 nm · c · d ⇔ c = A 205 nm
ε 205 nm · d
(4.5)
mit A 205 nm = Absorption, ε 205 nm = molarer Extinktionskoezient bei 205 nm (cm -1 mg/ml)
und d = Schichtdicke (cm).
Non Interfering Assay
Beim Non Interfering (NI) Assay werden Proteine präzipitiert und somit von Substanzen
getrennt, die bei der Bestimmung der Konzentration stören würden, z. B. DTT oder SDS.
Gefälltes Protein reagiert mit Kupfer-Ionen, wobei die ungebundenen Kupfer-Ionen mit Hilfe
einer chemischen Farbreaktion detektiert werden und die Farbintensität umgekehrt proportional
zur Proteinkonzentration ist. Die Nachweisgrenze liegt bei 500 ng Protein.
Für diese Methode wurde das NI Assay Kit nach Herstellerangaben verwendet. Die Konzentration
ungebundener Kupfer-Ionen wurde mittels photometrischer Messung der Absorption
bei 480 nm mit dem Spektrophotometer DU-640 bestimmt. Als Referenz diente eine Standardreihe
von 0 50 µg BSA.
Bradford Assay
Die Methode beruht auf einer Komplexierung des Farbstoes Coomassie Brilliantblau G 250
mit kationischen und unpolaren Seitenketten von Proteinen im sauren Milieu. Der freie Farbsto
besitzt ein Absorptionsmaximum bei 465 nm, der Komplex bei 595 nm. Die Absorption
bei 595 nm ist also proportional zur Proteinkonzentration [253].
Für diese Methode wurde das Bradford Assay Kit nach Herstellerangaben verwendet. Die
Konzentration von komplexiertem Coomassie Brilliantblau G 250 wurde mittels photometrischer
Messung der Absorption bei 595 nm mit dem Spektrophotometer DU-640 bestimmt. Als
Referenz diente eine Standardreihe von 0 20 µg BSA.
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