Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.1 Molekularbiologische Methoden
4.1.9 Transformation
Für die Einschleusung von Plasmiden in E. coli Stämme wurden sie einer Elektroporation
unterzogen. Dabei wird für einige Millisekunden ein elektrisches Feld an eine Zellsuspension
angelegt, um so die Zellwände zu permeabilisieren und die Aufnahme von Plasmiden zu
ermöglichen.
Es wurde 1/10 eines Ligationsansatzes (siehe Abschnitt 4.1.8) oder 10 ng Plasmid-DNA mit
40 µl elektrokompetenter E. coli Zellen (siehe Abschnitt 4.1.7) gemischt und in eine Elektroporationsküvette
mit 2 mm Spalt überführt. Der Elektroporator wurde auf 2,5 kV, 200 Ω
und 25 µF eingestellt und das elektrische Feld angelegt. Es wurde 1 ml auf 37 ◦ C temperiertes
LB-Medium hinzugefügt und für 1 h bei 37 ◦ C und 200 rpm inkubiert. Die Zellen wurden in
unterschiedlichen Verdünnungen auf LB-Agarplatten mit Selektionsantibiotikum ausplattiert,
um Einzelkolonien transformierter E. coli Bakterien zu erhalten. Es folgte eine Inkubation für
ca. 16 h bei 37 ◦ C. Die gewachsenen Kolonien wurden mittels PCR analysiert (siehe Abschnitt
4.1.10).
4.1.10 Untersuchung von E. coli Kolonien mittels PCR
Um zu verizieren, ob die nach einer Elektroporation (siehe Abschnitt 4.1.9) gewachsenen
Bakterienkolonien Plasmide in sich trugen, wurden sie mittels PCR analysiert. Im Falle einer
erfolgreichen Elektroporation war die Bindung der Primer an das Plasmid und die Ampli-
kation der entsprechenden Sequenz zu erwarten. Die Kolonien wurden mit einem sterilen
Zahnstocher in einen PCR-Ansatz überführt (siehe Abschnitt 4.1.1), der statt der Phusion
Polymerase 0,1 u/µl Taq Polymerase und den entsprechenden 1 × Puer enthielt. Tabelle 4.5
gibt eine Übersicht über die verwendeten Primer sowie das Temperaturprol. Im Anschluss
wurden die Amplikate mit Hilfe einer TAE-Agarose-Gelelektrophorese (siehe Abschnitt 4.1.3)
analysiert.
Primer Temperaturprol Amplikonlänge (bp)
pET41b fwd 94 ◦ C für 600 s 982
pET41b BlpI rev 25 Zyklen
94 ◦ C für 15 s
65 ◦ C für 15 s
72 ◦ C für 60 s
72 ◦ C für 600 s
4 ◦ C, ∞
Tabelle 4.5: Für die Analyse von Bakterienkolonien mittels PCR verwendete Primer sowie das Temperaturprol.
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