Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

1 Zusammenfassung
Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein hoch spezischer posttranskriptioneller Mechanismus zur
Genregulation, der in allen höheren Organismen bis hin zum Menschen vorkommt. Dabei
kommt es durch den Ribonukleoproteinkomplex RNA-induced silencing complex (RISC) zur
sequenzabhängigen Erkennung und Bindung einer target mRNA, deren Translation daraufhin
durch eine endonukleolytische Spaltung oder durch sterische Blockade verhindert wird. Die
Schlüsselkomponente des humanen RISC stellt das Argonaute2 Protein (hAgo2) dar, welches
mit der Nukleinsäurekomponente, einer guide RNA, assoziiert ist. Es setzt sich aus der N-
terminalen, Mid, PAZ und PIWI Domäne zusammen. Die Fähigkeit, beliebige guide RNAs
zu binden, macht hAgo2 zum molekularen Universalwerkzeug der Zelle. Diese Dissertation
beschäftigt sich mit der biochemischen und kinetischen Charakterisierung von rekombinantem
hAgo2 durch in vitro Studien.
Zunächst wurden für die Gewinnung ausreichender Mengen an enzymatisch aktivem, rekombinantem
hAgo2 teilweise parallel fünf verschiedene Expressions- und Reinigungssysteme
entworfen und getestet. Die zentralen Probleme stellten die schlechte Löslichkeit sowie die teilweise
unvollständige Translation der Fusionsproteine dar. Dennoch gelang u. a. die Gewinnung
von hAgo2 mit einer N-terminalen GST-Markierung unter nicht-denaturierenden Bedingungen
im Milligramm-Maÿstab mit hoher enzymatischer Aktivität. Alle hAgo2-Konstrukte wiesen
die typische sequenzspezische target RNA-Spaltung auf, wobei ein C-terminal modiziertes
Konstrukt einen drastisch verminderten Umsatz zeigte. Dies lässt sich auf eine gestörte Proteinfaltung
zurückführen und unterstreicht die ähnliche Domänenstruktur prokaryonter und
eukaryonter Ago Proteine. Weiterhin konnten Erkenntnisse über das Mg 2+ -Optimum sowie
das Oligomerisierungsverhalten von hAgo2 gewonnen werden. Es wurde eine Aggregationstendenz
festgestellt, die temperaturinduzierbar ist. Diese kann durch Zugabe von RNA fast
vollständig inhibiert werden.
Die Dissertation beschäftigte sich zentral mit der biochemischen und kinetischen Charakterisierung
der siRNA-vermittelten target RNA Spaltung durch hAgo2. Es gelang die Untergliederung
des Gesamtprozesses in vier Teilschritte (Beladung von hAgo2 mit siRNA, Erkennung
und Bindung der target RNA, ihre Spaltung und die Freisetzung der Spaltprodukte) sowie deren
individuelle experimentelle Untersuchung. Zunächst wurde die Beladung von hAgo2 analysiert.
Zu diesem Zweck konnte ein uoreszenzbasiertes System entwickelt werden, mit dessen
Hilfe die Bindungsreaktion von hAgo2 mit einzelsträngiger und doppelsträngiger siRNA unter
steady state und pre-steady state Bedingungen untersucht wurde. Es konnte erstmalig gezeigt
1